DNA甲基化酶和組蛋白去乙酰化酶抑制劑治療胰腺癌的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、胰腺癌是惡性程度最高的腫瘤之一,發(fā)病率和死亡率位居我國(guó)惡性腫瘤的前10位,且有逐年增高趨勢(shì)。預(yù)后極差,近50年來,盡管傳統(tǒng)的治療手段如手術(shù)、放療、化療或這些方法的聯(lián)合應(yīng)用取得許多重大進(jìn)展,但對(duì)胰腺癌患者的預(yù)后幾乎沒有顯著改善,胰腺癌死亡率依然近乎等于發(fā)病率。表觀遺傳學(xué)(Epigenetics)改變導(dǎo)致的基因表達(dá)改變是腫瘤發(fā)生的重要機(jī)制,包括DNA甲基化(DNA methylation)以及組蛋白去乙酰化(Histone Deacetyl

2、ation)等。DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑(DNAmcthyltransferases inhibitors,DNMTi)以及組蛋白去乙?；敢种苿?histonedeacetylase,inhibitors,HDACi)被證明在多種腫瘤中具有治療作用,可以使腫瘤中的抑癌基因重新表達(dá),誘導(dǎo)細(xì)胞分化、抑制生長(zhǎng),誘導(dǎo)凋亡等,但其具體的分子作用機(jī)制仍不清楚。 本課題旨在探討DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-AZA-dC(5-aza-deoxy

3、cytidine)和組蛋白去乙?；敢种苿┣啪?trichostatin A,TSA)聯(lián)合應(yīng)用對(duì)胰腺癌的治療作用。通過體外試驗(yàn)探討對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖、凋亡和細(xì)胞周期及其相關(guān)基因的影響,同時(shí)檢測(cè)增殖和凋亡相關(guān)基因表達(dá)的變化,體內(nèi)試驗(yàn)觀察對(duì)胰腺癌裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的抑制作用。初步探討其在治療胰腺癌的作用及其作用機(jī)制。 一、HDAC1蛋白和DNMT1蛋白在人胰腺癌組織中的表達(dá) 目的:檢測(cè)HDAC1蛋白和DNMT1蛋白在胰腺癌組織

4、和癌旁組織中的表達(dá)情況,并對(duì)其在組織中表達(dá)的一致性進(jìn)行相關(guān)性分析。 材料和方法:胰腺癌組織及相應(yīng)癌旁組織標(biāo)本23對(duì)。采用生物素-過氧化酶(streptavidin peroxidase,SP)免疫組織化學(xué)法檢測(cè)胰腺癌和癌旁組織HDAC1蛋白和DNMT1蛋白表達(dá),分析腫瘤組織與癌旁組織的陽(yáng)性率差別；同一組織來源相鄰切片進(jìn)行配對(duì),對(duì)HDAC1蛋白及DNMT1蛋白陽(yáng)性率進(jìn)行相關(guān)性分析。 結(jié)果: HDAC1蛋白及DNMT1蛋白均

5、在胰腺導(dǎo)管細(xì)胞癌組織細(xì)胞核表達(dá),染色為棕黃色,癌旁組織中多為陰性。胰腺癌與癌旁組織HDAC1蛋白表達(dá)陽(yáng)性率分別為56.21％±10.26％和6.24％±5.28％,DNMT1蛋白表達(dá)陽(yáng)性率分別為54.83％±23.33％和6.30％±10.78％,胰腺癌與癌旁組織陽(yáng)性率均有極顯著性差異(P=0.00)。相關(guān)性檢驗(yàn)顯示HDAC1蛋白與DNMT1蛋白表達(dá)相關(guān)系數(shù)0.713,有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.00)。 結(jié)論: HDAC1蛋白

6、及DNMT1蛋白在胰腺癌組織中的表達(dá)呈特異性,且其表達(dá)顯著相關(guān),提示HDAC1及DNMT1可能共同參與了胰腺癌的發(fā)生和發(fā)展。 二、TSA、5-AZA-dC對(duì)人胰腺癌細(xì)胞株增殖、凋亡和細(xì)胞周期的影響 目的:研究TSA、5-AZA-dC對(duì)體外培養(yǎng)的人胰腺癌細(xì)胞株增殖、凋亡和細(xì)胞周期的影響,觀察DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑與組蛋白去乙?；种苿┦欠窬哂袇f(xié)同抑制腫瘤的作用。 方法:分別以0.1、0.5、2.0μmol/L濃度

7、TSA干預(yù)胰腺癌PaTu8988細(xì)胞株24小時(shí),0.5、2.0、10.0μmol/L濃度5-AZA-dC干預(yù)胰腺癌PaTu8988細(xì)胞株72小時(shí)后,以及2種藥物聯(lián)合治療,按照給藥濃度不同分為聯(lián)合低、中、高濃度組4組,分別給予5-AZA-dC 0.5、2.0及10μmol/L,干預(yù)48小時(shí),最后24小時(shí)給予TSA 0.5μmol/L。采用WST-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖變化,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期及凋亡的改變。 結(jié)果: 1.細(xì)胞增殖試驗(yàn):

8、TSA0.1、0.5、2.0μmol/組細(xì)胞存活率分別為95.11％±4.36％、77.84％±13.58％、69.78％±7.04％,與對(duì)照組相比差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。5-AZA-dC 0.5、2.0和10.0μmol/L組細(xì)胞存活率分別為94.91％±1.51％、88.19％±3.28％、81.93％±4.89％,其中2.0和10.0μmol/L組與對(duì)照組相比差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),三組間相比有顯著統(tǒng)計(jì)

9、學(xué)意義(P<0.05)。聯(lián)合治療低、中和高濃度組細(xì)胞存活率分別為86.69％±9.07％、72.86％±4.19％及57.20％±9.67％,與對(duì)照組比較,低濃度組有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)而另二組均有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01),提示聯(lián)合治療較單獨(dú)用藥可以達(dá)到更好的治療效果。2.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期：TSA組G2/M期細(xì)胞百分率、凋亡細(xì)胞百分率均顯著高于對(duì)照組(均P<0.01),表現(xiàn)為G2/M期阻滯及細(xì)胞凋亡率增加。5-A

10、ZA-dC組G2/M及S期細(xì)胞百分率均高于對(duì)照組(P<0.05),亦表現(xiàn)為G2/M期阻滯。 結(jié)論: TSA及5-AZA-dC均能有效地抑制胰腺癌PaTu8988細(xì)胞株的增殖,TSA及5-AZA-dC均通過阻斷細(xì)胞周期停滯于G2/M期,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。 三、TSA、5-AZA-dC對(duì)增殖、凋亡及細(xì)胞周期相關(guān)基因表達(dá)的影響 目的: TSA、5-AZA-dC干預(yù)胰腺癌細(xì)胞株出現(xiàn)細(xì)胞周期阻滯并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,但其發(fā)生的分子機(jī)

11、制尚不清楚,通過Real-time RT-PCR檢測(cè)藥物干預(yù)前后細(xì)胞周期及凋亡相關(guān)基因及蛋白表達(dá)的改變,并檢測(cè)DNMT酶總體活性的變化,探討抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡的作用機(jī)制。 材料和方法: TSA及5-AZA-dC干預(yù)胰腺癌細(xì)胞株,抽提細(xì)胞株總RNA,Real-time RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞周期相關(guān)基因p21和Cyclin D1、凋亡相關(guān)基因Bax和Bcl-2的表達(dá)變化,Western Blot檢測(cè)蛋白表達(dá),抽提核蛋白檢測(cè)D

12、NMT酶總體活性。 結(jié)果: 1.細(xì)胞周期相關(guān)基因改變：與對(duì)照組比較,TSA組p21表達(dá)明顯升高,Cyclin D1表達(dá)則明顯降低,有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05);5-AZA-dC組p21表達(dá)升高,其中2.0μmol/L及10.0μmol/L濃度有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),Cyclin D1表達(dá)則略降低,但無顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Western Blot檢測(cè)相應(yīng)的蛋白表達(dá)與其基因改變呈一致性。2.凋亡相關(guān)基因改變：與對(duì)照組

13、比較,TSA組Bax表達(dá)無顯著變化,Bcl-2表達(dá)則呈下降趨勢(shì),2.0μmol/L濃度與對(duì)照組比較顯示有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05);5-AZA-dC組Bax表達(dá)呈升高趨勢(shì),但僅有10.0μmol/L有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),而:Bcl-2表達(dá)雖有降低,但無顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Western Blot檢測(cè)相應(yīng)的蛋白表達(dá)與其基因改變呈一致性。 結(jié)論: TSA及5-AZA-dC通過上調(diào)p21和/或下調(diào)Cyclin D1基因表達(dá)

14、,導(dǎo)致其相關(guān)蛋白發(fā)生表達(dá)量改變,調(diào)控胰腺癌PaTu8988細(xì)胞周期,抑制細(xì)胞增殖和分化,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,從而抑制了胰腺癌PaTu8988細(xì)胞株的生長(zhǎng)。 四、TSA、5-AZA-dC對(duì)胰腺癌細(xì)胞裸鼠移植瘤的抑制作用 目的:評(píng)價(jià)TSA、5-AZA-dC對(duì)胰腺癌細(xì)胞裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的影響,探討TSA、5-AZA-dC的抗腫瘤治療價(jià)值。 方法:將人胰腺癌細(xì)胞PaTu8988接種至裸鼠背部皮下,隨機(jī)分為對(duì)照組、TSA組、5-A

15、ZA-dC組和聯(lián)合組4組,單次給藥劑量分別為PBS 0.2ml、TSAlmg/kg、5-AZA-dC 3mg/kg和TSA 1mg/kg+5-AZA-dC 3mg/kg,以腹腔注射途徑給藥,隔日1次,共5次,觀察裸鼠生命體征變化以及腫瘤大小的動(dòng)態(tài)變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死裸鼠切除腫瘤標(biāo)本和臟器組織,進(jìn)行免疫組化和HE染色,Real-time RT-PCR檢測(cè)裸鼠移植瘤組織增殖及凋亡相關(guān)基因的表達(dá)。 結(jié)果: 1.移植瘤生長(zhǎng)曲線顯示與對(duì)照

16、組比較,TSA與5-AZA-dC均可使腫瘤生長(zhǎng)速度減慢,腫瘤體積在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均小于對(duì)照組,聯(lián)合治療組對(duì)腫瘤的抑制作用最為明顯,其次為TSA,各組與對(duì)照組相比差異具有顯著性(P<0.05),聯(lián)合治療組與對(duì)照組相比具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。2.細(xì)胞周期及凋亡相關(guān)基因mRNA改變：與對(duì)照組比較,TSA組p21明顯升高(P<0.01),Cyclin D1明顯降低(P<0.05),Bax無顯著變化,Bcl-2呈下降趨勢(shì)；5-AZA-d