香煙煙霧對(duì)人氣道平滑肌細(xì)胞增殖和凋亡失衡的影響及機(jī)制研究.pdf

1、目的： 1．觀(guān)察在不同濃度及時(shí)間的香煙煙霧作用下,人氣道平滑肌細(xì)胞增殖和凋亡的變化趨勢(shì)； 2. 探討香煙煙霧促進(jìn)人氣道平滑肌細(xì)胞增殖/凋亡失衡是否通過(guò)線(xiàn)粒體凋亡途徑或死亡受體途徑進(jìn)行，及是否受Bcl-2家族和TNFR超家族的調(diào)控； 3．探討在香煙煙霧作用下，人氣道平滑肌細(xì)胞中ROS的變化是否調(diào)控細(xì)胞周期調(diào)控因子NF-κB的表達(dá)，進(jìn)而影響平滑肌細(xì)胞的增殖和凋亡。 材料與方法： 本實(shí)驗(yàn)采用組織塊貼壁法

2、原代培養(yǎng)人氣道平滑肌細(xì)胞（HASMCs），用胰蛋白酶消化法傳代細(xì)胞，并將HASMCs隨機(jī)分成4個(gè)時(shí)間干預(yù)組：2.5％CSE、5％CSE、10％CSE和20％CSE組，3個(gè)時(shí)間干預(yù)組：24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)組及對(duì)照組。用四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）比色法和增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測(cè)不同組細(xì)胞的增殖程度和活性情況。AO/EB熒光染色和流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化和細(xì)胞周期動(dòng)力學(xué)變化。運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈

3、反應(yīng)（Realtime- PCR）檢測(cè)不同濃度和時(shí)間CSE作用下Bcl-2、Bax、Bad、Fas、FasL和NF-κB在mRNA水平的變化。用免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)不同濃度CSE作用后Bcl-2和Bax在蛋白水平的變化。用硝基四氮唑藍(lán)（NBT）還原實(shí)驗(yàn)和DCFH－DA熒光染色法檢測(cè)HASMCs中活性氧（ROS）的表達(dá)水平。 結(jié)果： 1. 除了2.5％CSE 24小時(shí)干預(yù)組細(xì)胞有少許促增殖作用外，CSE對(duì)HASMC的增殖主要

4、起著抑制作用，且隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)和CSE濃度的增加，細(xì)胞增殖受抑的程度也增加，細(xì)胞增殖速度減慢，呈劑量－效應(yīng)關(guān)系和時(shí)間－效應(yīng)關(guān)系（n=6,P<0.05）。 2. 與對(duì)照組比較，AO/EB染色結(jié)果顯示：隨著CSE干預(yù)濃度的增高，HASMC的凋亡和壞死率均增加，但是凋亡細(xì)胞占據(jù)死亡細(xì)胞的大多數(shù)。流式細(xì)胞周期分析顯示：10％CSE作用于HASMC不同時(shí)段以后，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，與對(duì)照組（1.74±0.21）相比，24小時(shí)組（2.3

5、6±0.24），48小時(shí)組（7.02±0.39）和72小時(shí)組（17.39±0.87）亞G1期的凋亡細(xì)胞所占的比例呈增加的趨勢(shì)（n=6,P<0.01）；不同濃度的CSE作用于HASMC 48h以后，可見(jiàn)隨著CSE濃度的增加，與對(duì)照組（1.74±0.21）比較，2.5％CSE組（2.46±0.11），5％CSE組（3.01±0.15），10％CSE組（7.02±0.39）和20％CSE組（13.48±0.52）處于亞G1期的凋亡細(xì)胞所占比例

6、呈增加趨勢(shì)（n=6,P<0.01）。 3. 與對(duì)照組比較，CSE各干預(yù)組中Bcl-2 mRNA水平表達(dá)下降，Bax、Fas mRNA水平表達(dá)上升，且呈時(shí)間和濃度依賴(lài)性（n=3,P<0.05）；Bad mRNA水平表達(dá)在各CSE濃度干預(yù)組均呈濃度依賴(lài)性升高，但不呈規(guī)律的時(shí)間依賴(lài)性（n=3,P<0.05）；FasL mRNA水平表達(dá)無(wú)明顯變化。 4. 與對(duì)照組比較，CSE各干預(yù)組中Bcl-2和Bax的蛋白表達(dá)水平分別呈濃度和

7、時(shí)間依賴(lài)性降低和增高（n=3,P<0.05）。 5．與對(duì)照組比較，各CSE干預(yù)組HASMC胞內(nèi)及總的ROS含量呈時(shí)間和濃度依賴(lài)性升高（n=6,P<0.05），NF-κB在mRNA水平表達(dá)除在2.5％CSE 24小時(shí)組表達(dá)增高以外，在其余各組的表達(dá)呈時(shí)間和濃度依賴(lài)型降低（n=3,P<0.05），NF－κB的P65亞基和P50亞基的表達(dá)一致，均符合上述規(guī)律。 結(jié)論： 低濃度（﹤2.5％CSE）短時(shí)間（24小時(shí)內(nèi)）香煙

8、煙霧作用下可引起人氣道平滑肌細(xì)胞增殖，超過(guò)此濃度和時(shí)間范圍外，香煙煙霧則抑制氣道平滑肌細(xì)胞的增殖及促進(jìn)其凋亡并呈CSE時(shí)間和濃度依賴(lài)性。細(xì)胞凋亡的水平與Bcl-2家族抗凋亡基因（Bcl-2）/促凋亡基因（Bax、Bad）比例失衡，Bcl-2/Bax蛋白表達(dá)比例失衡以及TNFR超家族中Fas基因表達(dá)增加相關(guān)。并且，隨著CSE干預(yù)濃度和時(shí)間的增加，HASMCs內(nèi)ROS的含量亦隨之增加，其在低水平條件下可以促進(jìn)NF-κB基因表達(dá)的增加，在高水

9、平條件下則抑制NF-κB基因的表達(dá)，這種變化趨勢(shì)與細(xì)胞的增殖和凋亡趨勢(shì)相符。這些說(shuō)明：1.除了在較低濃度條件下以外，CSE對(duì)HASMC的主要作用是抑制增殖和促進(jìn)凋亡引起增殖/凋亡比例失衡，這可能是吸煙COPD患者發(fā)病的重要作用機(jī)制；2.在HASMCs中，香煙煙霧對(duì)其的促凋亡作用可以通過(guò)線(xiàn)粒體途徑和死亡受體途徑進(jìn)行，但是線(xiàn)粒體途徑的作用較死亡受體途徑更為明顯；3.氣道平滑肌細(xì)胞中ROS含量是與香煙煙霧的濃度和作用時(shí)間成正比增加的，但是RO