血管緊張素Ⅱ對人氣道平滑肌細胞增殖的影響及機制探討.pdf

1、背景：氣道平滑肌細胞（Airway smooth muscle cell，ASMC）異常過度增殖是支氣管哮喘（哮喘）氣道重塑的重要特征。自1922年首次在尸檢中發(fā)現哮喘致死患者的氣道平滑肌層顯著增厚，接下來的眾多研究也證實了各階段哮喘患者均存在不同程度的氣道平滑肌容量增加。增厚的氣道平滑肌收縮能力增強，且對變應原的反應性增加;同時平滑肌層增厚導致氣道管徑變窄，氣流受限程度加劇。氣道平滑肌過度增殖與哮喘嚴重程度相關，是導致氣流受限向不可逆

2、發(fā)展的關鍵環(huán)節(jié)。目前治療哮喘的瓶頸在于，雖然糖皮質激素、支氣管舒張劑能夠很好地控制和緩解哮喘發(fā)作，但無法阻止和逆轉不可逆氣流受限的發(fā)展。抑制氣道平滑肌增殖可能成為治療哮喘的新靶點，因此，研究ASMC增殖的機制十分必要。在哮喘的炎性氣道環(huán)境中，多種因素可引起ASMC增殖增加，主要有:生長因子、細胞因子、炎癥介質、以及多種酶類。這些有絲分裂原作用于細胞膜上的相應受體，引起下游一系列信號通路的激活，其中研究的最多的是細胞外信號調節(jié)激酶(ext

3、racellular signal-regulated kinase，ERK)通路。細胞外信號經傳導、放大、整合后入核，導致轉錄因子釋放，細胞周期蛋白D1(Cyclin D1)表達，推動細胞進入有絲分裂周期而完成增殖過程。血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)是腎素-血管緊張素系統（RAS）的重要成員，以往認為其主要作用是調節(jié)血壓及體液平衡。近年來的大量研究證實，AngⅡ還與細胞增殖、凋亡、遷移、分化、炎癥反應及免疫調節(jié)等多種生物學行為有關。有研究表

4、明，哮喘發(fā)作時伴有肺臟局部RAS的活化，血漿AngⅡ水平升高。AngⅡ與ASMC增殖是否存在關聯，目前的研究結果并不明確，且其機制尚未充分闡明。本研究將AngⅡ、AngⅡ受體拮抗劑Losartan、ERK激酶抑制劑PD98059分別或同時作用于原代培養(yǎng)的人ASMC，從活細胞酶水平、細胞周期兩個層面檢測細胞增殖情況，檢測Cycling D1mRNA及蛋白表達水平，并檢測ERK磷酸化水平，旨在探討AngⅡ對ASMC增殖的影響并初步探討其作用

5、機制。
　　 目的：①原代培養(yǎng)人ASMC，并觀察其在體外培養(yǎng)時的特點，并鑒定所培養(yǎng)的細胞為平滑肌細胞;②探討AngⅡ對人ASMC增殖的作用，并觀察AngⅡ受體拮抗劑Losartan、ERK激酶抑制劑PD98059對上述作用的影響;觀察AngⅡ對人ASMC細胞周期的影響，及Losartan、PD98059的作用;③分別從mRNA及蛋白水平檢測AngⅡ對人ASMC細胞周期蛋白D1(CyclinD1)表達的影響，及Losartan、P

6、D98059的作用;④檢測AngⅡ對人ASMC細胞外信號調節(jié)激酶(ERK)磷酸化水平的影響，及Losartan、PD98059的作用;
　　 方法：⑴原代培養(yǎng):取肺葉切除術患者手術標本，無菌條件下分離葉、段支氣管中膜平滑肌層，剪成約1mm3大小貼于培養(yǎng)瓶底，間隔約0.5cm，加入含20％胎牛血清的DMEM，置37℃、5％CO2孵箱中培養(yǎng);⑵傳代培養(yǎng):待細胞從組織塊周圍爬出并生長融合，占培養(yǎng)皿底面積的70～80％時，以1∶2～1∶

7、4傳代于培養(yǎng)瓶，用含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng);⑶細胞純化:細胞純化采用機械刮除法、差異貼壁法及自然純化;⑷細胞鑒定:用免疫熒光法對所培養(yǎng)細胞進行平滑肌特異的α肌動蛋白(α-SMA)特異性染色，鑒定其是否為平滑肌細胞;⑸后續(xù)處理:取3-6代對數生長期細胞，以5×103/孔接種于96孔培養(yǎng)板或1×104/cm2接種于培養(yǎng)皿，用于實驗研究;⑹按上述方法接種于96孔板的細胞用于MTT（四甲基偶氮唑鹽）法細胞增殖檢測，接種于60mm培養(yǎng)皿的細

8、胞用于細胞周期檢測;⑺以10-8～10-5mol/L濃度梯度的AngⅡ作用于細胞24h，檢測細胞增殖情況，觀察各個濃度AngⅡ對細胞增殖的影響;⑻細胞隨機分為對照組、AngⅡ組、Losartan組、AngⅡ+Losartan組、PD98059組、AngⅡ+PD98059組，給予相應干預劑刺激24h后，進行增殖檢測;⑼培養(yǎng)結束后用多功能酶標儀檢測各組490nm波長處吸光度值，以A490表示;⑽流式細胞術PI單染法分析處于細胞周期不同階段的

9、細胞百分比;⑾各組數據用（(x)±s）表示，方差齊時多組間比較采用F檢驗，多重比較采用q檢驗，方差不齊時方差分析采用Welch法，多重比較采用Dunnett T3法。檢驗水準為α=0.05，P≤0.05為差異有統計學意義;⑿上述細胞接種于35mm/60mm培養(yǎng)皿，生長至培養(yǎng)皿底面積70-80％時用于提取總RNA或蛋白;⒀檢測Cyclin D1 mRNA表達:用接種于35mm培養(yǎng)皿中的細胞提取細胞總RNA，并逆轉錄為cDNA，實時熒光定量

10、PCR對Cyclin D1特異性片段進行擴增，讀取各組CT值，計算2-ΔΔCT表示Cyclin D1 mRNA相對表達量;⒁用接種于60mm培養(yǎng)皿中的細胞提取細胞總蛋白，Westem Blot檢測各組Cyclin D1蛋白表達水平，以β-actin作為內參，計算CyclinD1與β-actin條帶灰度值之比表示Cyclin D1蛋白表達水平;⒂數據以（(x)±s）表示，進行方差分析比較組間差異，方差齊時采用F檢驗，多重比較采用q檢驗，方

11、差不齊時采用Welch法，多重比較采用DunnettT3法。檢驗水準為α=0.05，P≤0.05為差異有統計學意義;⒃細胞接種于60mm培養(yǎng)皿，生長至培養(yǎng)皿底面積70-80％時進行信號通路檢測;⒄提取細胞總蛋白，Western Blot檢測各組ERK及p-ERK水平，計算p-ERK與ERK條帶灰度值之比表示ERK磷酸化水平，即ERK通路活化情況;⒅數據以（(x)±s）表示，進行方差分析比較組間差異，方差齊時采用F檢驗，多重比較采用q檢驗

12、，方差不齊時采用Welch法，多重比較采用DunnettT3法。檢驗水準為α=0.05，P≤0.05為差異有統計學意義。
　　 結果：①2～3周后，貼于培養(yǎng)瓶底部的平滑肌組織塊周圍陸續(xù)可見細胞爬出，普通光鏡下觀察，細胞貼壁生長，呈長梭形，卵圓形胞核位于細胞中央，可見1個或多個核仁;②細胞繼續(xù)生長1周左右，相鄰組織塊爬出的細胞開始融合，傳代后12h觀察，細胞貼壁良好，2～3天后融合，排列規(guī)律呈典型“峰谷征”;③細胞免疫熒光染色95

13、％以上細胞α-SMA表達陽性;④以5×103/孔接種于96孔培養(yǎng)板或1×104/cm2接種于培養(yǎng)皿，24h后可覆蓋培養(yǎng)物底部面積的70-80％;⑤對照組、10-8、10-7、10-6、10-5mol/L濃度組細胞A490值分別為:0.396±0.029、0.416±0.035、0.500±0.050、0.483±0.059、0.450±0.051;與對照組相比，10-7～10-5mol/L濃度的AngⅡ均可引起ASMC增殖顯著增加，差異

14、有統計學意義（P＜0.01），其中10-7mol/L濃度的AngⅡ作用最為明顯;⑥不同干預劑作用24h后，對照組、AngⅡ組、Losartan組、AngⅡ+Losartan組、PD98059組、AngⅡ+PD98059組細胞A490值分別為:0.386±0.021、0.531±0.043、0.380±0.019、0.395±0.018、0.393±0.024、0.389±0.028，其中AngⅡ組高于對照組，差異有統計學意義(P＜0.0

15、1)，Losartan組及PD98059組與對照組差異無統計學意義，AngⅡ+Losartan組及AngⅡ+PD98059組低于AngⅡ組，差異有統計學意義（均P＜0.01）;⑦不同干預劑作用24h后，對照組、AngⅡ組、Losartan組、AngⅡ+Losartan組、PD98059組、AngⅡ+PD98059組Cyclin D1 mRNA相對表達水平分別為:1.00±0.17、1.57±0.26、0.95±0.09、0.91±0.2

16、1、0.77±0.09、0.84±0.04，與對照組相，比，AngⅡ組Cyclin D1 mRNA表達升高，差異有統計學意義(P＜0.01)，Losartan組及PD98059組與對照組差異無統計學意義，與AngⅡ組相比，AngⅡ+Losartan組及AngⅡ+PD98059組Cyclin D1 mRNA表達降低，差異有統計學意義（均P＜0.01）;⑧干預劑作用24h后，對照組、AngⅡ組、Losartan組、AngⅡ+Losartan

17、組、PD98059組、AngⅡ+PD98059組Cyclin D1蛋白表達水平分別為:0.224±0.074、0.527±0.082、0.312±0.036、0.291±0.094、0.286±0.059、0.226±0.047，與對照組相比，AngⅡ組Cyclin D1蛋白表達水平升高，差異有統計學意義(P＜0.01)，Losartan組及PD98059組與對照組差異無統計學意義，與AngⅡ組相比，AngⅡ+Losartan組及Ang

18、Ⅱ+PD98059組Cyclin D1蛋白表達降低，差異有統計學意義（均P＜0.01）;⑨不同干預劑作用15min后，對照組、AngⅡ組、Losartan組、AngⅡ+Losartan組、PD98059組、AngⅡ+PD98059組ERK磷酸化水平分別為:0.306±0.049、0.641±0.153、0.245±0.053、0.212±0.073、0.221±0.036、0.211±0.060，與對照組相比，AngⅡ組ERK磷酸化水平

19、升高，差異有統計學意義(P＜0.01)，Losartan組及PD98059組與對照組差異無統計學意義，與AngⅡ組相比，AngⅡ+Losartan組及AngⅡ+PD98059組ERK磷酸化水平降低，差異有統計學意義（均P＜0.01）。
　　 結論：⑴組織塊貼壁法培養(yǎng)ASMC周期約為1個月，5×103/孔接種于96孔培養(yǎng)板或1×104/cm2接種于培養(yǎng)皿是合適的接種密度;細胞經免疫熒光染色鑒定，表達平滑肌特異的α-SMA，純度達9

20、5％;⑵AngⅡ可引起人ASMC增殖增加，以10-7mol/L濃度作用最為明顯;AngⅡ處理組較對照組細胞總數增加，同時處于G0G1期的細胞百分比減少，S及G2M期細胞百分比增加;阻斷AngⅡ受體或ERK信號通路均可逆轉AngⅡ的促增殖效應;⑶AngⅡ可誘導人ASMC Cyclin D1 mRNA及蛋白合成增加;阻斷AngⅡ受體或ERK信號通路均可消除AngⅡ對Cyclin D1的影響;⑷AngⅡ可活化ERK通路，使ERK磷酸化水平升高