JAK-STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在肝纖維化發(fā)病機(jī)制中作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、肝纖維化是指肝臟內(nèi)彌漫性細(xì)胞外基質(zhì)(特別是膠原)過度沉積.它不是一個(gè)獨(dú)立的疾病,而是許多慢性肝病共同的病理過程,包括酒精性、病毒性、遺傳代謝性、自身免疫性等都能導(dǎo)致肝組織纖維化的形成。目前,大多數(shù)抗肝纖維化藥物臨床效果不顯著,或者藥物毒性太大,實(shí)際應(yīng)用受到限制。JAK/STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一,參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡以及免疫調(diào)節(jié)等很多重要的生物學(xué)過程。有研究證實(shí)JAK/STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與肝纖維化有極其密切的

2、聯(lián)系,但具體的分子機(jī)制尚不清楚。因此,本實(shí)驗(yàn)研究探討JAK/STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在肝纖維發(fā)病機(jī)制中的作用及中成藥扶正化瘀方對(duì)JAK/STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在肝纖維發(fā)生的影響。實(shí)驗(yàn)分為兩部分,第一部分采用四氯化碳誘導(dǎo)大鼠肝纖維化模型,探討肝纖維化造模過程及自發(fā)逆轉(zhuǎn)過程中JAK/STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的動(dòng)態(tài)變化,以此闡明JAK/STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在肝纖維化過程中的發(fā)病機(jī)制。第二部分采用四氯化碳誘導(dǎo)大鼠肝纖維化模型,給予扶正化瘀干預(yù),闡明扶正化

3、瘀對(duì)纖維化JAK/STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響,為中藥扶正化瘀的繼續(xù)研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù),為臨床抗肝纖維化的治療尋求更廣的途徑。
　　 第一部分:JAK/STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在自發(fā)逆轉(zhuǎn)肝纖維化模型的動(dòng)態(tài)變化;
　　 目的:
　　 肝纖維化(hepatic fibrosis)是指在不同病因的作用下,造成肝細(xì)胞慢性損傷及某些非實(shí)質(zhì)細(xì)胞激活,引起纖維增生和纖維分解的不平衡,造成纖維結(jié)締組織的過度沉積從而形成肝纖維化,其發(fā)展的

4、后果是形成不可逆轉(zhuǎn)的肝硬化階段。大量實(shí)驗(yàn)研究,肝星狀細(xì)胞(hepatic stellatecell,HSC)證實(shí)為致肝纖維化的主要細(xì)胞,也是各種誘導(dǎo)肝纖維化因素發(fā)生的共同中心環(huán)節(jié),HSC大量合成ECM,其也為ECM的主要來源。因此,HSC激活與肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展有著極其密切的聯(lián)系,活化HSC已被看作抗肝纖維化治療的主要靶點(diǎn)。目前,有研究表明JAK/STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在肝纖維化過程密切相關(guān),但其作用的分子機(jī)制尚不清楚。因此,我們建立C

5、Cl4誘導(dǎo)大鼠肝纖維化模型,探討JAK/STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在肝纖維化形成過程及自發(fā)逆轉(zhuǎn)過程中JAK1及STAT3的動(dòng)態(tài)變化,闡明JAK/STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在肝纖維化形成過程及自發(fā)逆轉(zhuǎn)中的分子機(jī)制,為抗肝纖維化藥物的研發(fā)提供理論基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 選取8周齡的健康雄性Wistar大鼠66只,體重180～200g,購于河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。經(jīng)過適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后,隨機(jī)分兩組:對(duì)照組18只、肝纖維化自發(fā)逆轉(zhuǎn)模型組

6、(簡(jiǎn)稱模型組)48只。對(duì)照組予生理鹽水腹腔注射(0.2ml/100g),每周2次,共8周;模型組予30％CCL4橄欖油腹腔注射(0.2ml/100g),每周2次;至第8周肝纖維化模型形成,CCL4停止給藥。開始造模后的第4、6、8、10、12周分別處死8只大鼠,對(duì)照組于第4、6、8、10、12周末隨機(jī)取處死大鼠3只,于第14周處死對(duì)照及模型組剩余全部大鼠。留取大鼠血清檢測(cè)肝功能ALT、AST;留取部分肝組織置于凍存管放于-80℃冰箱凍存

7、用于檢測(cè)羥脯氨酸及提取肝組織總RNA,逆轉(zhuǎn)錄.聚合酶鏈反應(yīng)法(RT-PCR)檢測(cè)大鼠肝組織JAK1、STAT3mRNA表達(dá);留取部分肝組織置于10％的中性福爾馬林固定,石蠟包埋,蘇木精—伊紅(HE)染色及Masson染色觀察肝組織病理學(xué)改變;應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色法觀察肝組織JAK1、STAT3蛋白的表達(dá);
　　 結(jié)果:
　　 1:實(shí)驗(yàn)大鼠的健康狀況:對(duì)照組大鼠的活動(dòng)能力強(qiáng),食欲旺盛,毛發(fā)光澤且整齊,精神營(yíng)養(yǎng)狀況好,每周體

8、重的增加正常。模型組造模階段大鼠隨著腹腔注入CCL4時(shí)間的延長(zhǎng),食欲開始下降,且精神萎靡,營(yíng)養(yǎng)狀況差,毛發(fā)失去色澤,體重增長(zhǎng)緩慢,個(gè)別易激惹。8周后停用CCL4進(jìn)入模型組自發(fā)逆轉(zhuǎn)階段后,大鼠食欲有所增加,精神、營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)較前好轉(zhuǎn),體重有所增加。
　　 2:實(shí)驗(yàn)大鼠血清ALT、AST水平檢測(cè):模型組大鼠血清第4、6、8、10、12、14周末血清ALT水平分別為:72.38±4.25 U/L、143.67±8.97U/L、264.61

9、±14.63U/L、182.41±10.57U/L、112.64±14.15U/L、50.27±2.05U/L,均高于對(duì)照組(16.69±2.04U/L),且各時(shí)間點(diǎn)之間均有明顯差異(P＜0.05);AST分別為:182.35±4.12U/L、323.53±11.50U/L、501.04±24.15U/L、401.22±21.35U/L、140.20±10.33U/L、94.00±11.21 U/L,均高于對(duì)照組(17.21±2.341

10、U/L),模型組逆轉(zhuǎn)期大鼠血清ALT、AST水平明顯低于造模期。
　　 3:實(shí)驗(yàn)大鼠肝組織中羥脯氨酸(HYP)水平測(cè)定:模型組大鼠肝組織第4、6、8、10、12、14周末HYP水平依次為:195.97±17.90、346.35±15.25、478.80±8.16、414.62±10.04、361.42±14.06、296.58±16.51,均高于對(duì)照組(104.57±14.72),模型組逆轉(zhuǎn)期大鼠肝組織羥脯氨酸(HYP)水平明顯

11、低于造模期。
　　 4:實(shí)驗(yàn)大鼠肝臟病理學(xué)變化:肉眼觀察對(duì)照組大鼠肝組織呈紅褐色,質(zhì)地柔軟,有光澤,邊緣光滑。模型組中肝組織與周圍組織粘連,呈暗紅色,體積較正常肝組織小,邊緣變鈍,表面有質(zhì)粒感。
　　 5:實(shí)驗(yàn)大鼠肝組織JAK1與STAT3蛋白表達(dá)情況:JAK1免疫組化染色陽性細(xì)胞為胞漿內(nèi)表達(dá)棕黃色顆粒;STAT3免疫組化染色陽性細(xì)胞為胞核內(nèi)表達(dá)棕黃色顆粒。對(duì)照組肝組織中僅有少量陽性細(xì)胞分布。模型組隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng),肝

12、組織中JAK1和STAT3陽性表達(dá)細(xì)胞逐漸增多;8周末停用四氯化碳后,隨著肝細(xì)胞的自我修復(fù),肝細(xì)胞炎性及纖維化程度降低,JAK1和STAT3陽性表達(dá)細(xì)胞逐漸減少。模型組第4、6、8、10、12、14周末JAK1、STAT3陽性光密度值分別為(0.55±0.02、1.23±0.15、2.73±0.17、2.12±0.11、1.69±0.18、1.20±0.12)、(0.82±0.03、1.53±0.11、2.89±0.13、2.20±0.

13、14、1.73±0.13、1.24±0.03)均顯著高于對(duì)照組(0.21±0.04)、(0.24±0.06),P＜0.05;模型組逆轉(zhuǎn)期大鼠肝組織JAK1與STAT3蛋白表達(dá)明顯低于造模期。
　　 6:實(shí)驗(yàn)大鼠肝組織JAK1與STAT3 mRNA表達(dá)情況:模型組第4、6、8、10、12、14周末肝組織中JAK1和STAT3 mRNA表達(dá)量分別為(0.76±0.04、1.54±0.06、2.48±0.03、1.99±0.10、1.

14、51±0.11、1.12±0.10)、(0.81±0.09、1.65±0.07、2.66±0.10、2.02±0.04、1.61±0.11、1.20±0.07)均顯著高于對(duì)照組(0.52±0.03)、(0.56±0.02),P＜0.05;模型組逆轉(zhuǎn)期大鼠肝組織JAK1與STAT3mRNA表達(dá)明顯低于造模期。
　　 7:實(shí)驗(yàn)大鼠肝組織JAK1、STAT3 mRNA表達(dá)與肝組織HYP水平相關(guān)關(guān)系:實(shí)驗(yàn)大鼠肝組織JAK1mRNA表達(dá)與

15、肝組織HYP水平、STAT3 mRNA表達(dá)與肝組織HYP水平之間的關(guān)系符合直線回歸關(guān)系r=0.986,r=0.994,P＜0.05,(Fig30、Fig31)。
　　 結(jié)論:
　　 1:大鼠經(jīng)四氯化碳腹腔注射8周可誘導(dǎo)具有典型肝纖維化特征的動(dòng)物模型,消除四氯化碳致纖維化因素后,可以部分逆轉(zhuǎn)動(dòng)物模型肝組織的纖維化。
　　 2:JAK/STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在肝纖維化動(dòng)態(tài)進(jìn)展過程中JAK1和STAT3蛋白及mRNA表達(dá)

16、增多,JAK1和STAT3mRNA表達(dá)水平與HYP水平存在相關(guān)關(guān)系,參與肝纖維化形成過程。
　　 3：JAK/STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在自發(fā)逆轉(zhuǎn)肝纖維過程中JAK1和STAT3蛋白及mRNA表達(dá)明顯下降,參與大鼠肝纖維化自發(fā)逆轉(zhuǎn)過程,提示JAK/STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在肝纖維發(fā)病機(jī)制中具有重要作用。
　　 第二部分：扶正化瘀方對(duì)肝纖維化大鼠JAK/STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的作用。
　　 目的:
　　 各種因素造成肝

17、細(xì)胞的炎癥及慢性損傷,導(dǎo)致肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell,HSC)激活,引起ECM的大量合成,造成纖維結(jié)締組織的過度沉積從而形成肝纖維化。因此,HSC是合成ECM的主要來源,也是不同致病因素導(dǎo)致肝纖維化發(fā)生的共同中心環(huán)節(jié),活化HSC已被看作抗肝纖維化治療的主要靶點(diǎn)。目前,HSC激活的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路研究較多的有NF-κB通路、TGF-β/Smad通路、MAPK通路,而JAK/STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被許多研究證實(shí)在HSC

18、激活、肝纖維形成過程中具有重要作用。近來,中藥在抗肝纖維化方面作用顯著,日益受到人們的重視,中藥具有多靶點(diǎn)、多途徑的綜合藥理作用。扶正化瘀方是由丹參、蟲草菌絲、桃仁、五味子等6味中藥所組成和提取的臨床抗肝纖維化治療藥物,它的中醫(yī)理論基于“氣陰兩虛、血瘀阻絡(luò)”的肝纖維化中醫(yī)病機(jī)。本研究探討扶正化瘀方對(duì)大鼠肝纖維JAK/STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的作用效果及機(jī)制,為抗肝纖維化的藥物提供新的理論依據(jù)及闡明機(jī)制。
　　 方法:
　　

19、選取8周齡的健康雄性Wistar大鼠57只,體重180～200g,購于河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。經(jīng)過適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后,隨機(jī)分三組:對(duì)照組9只、模型組24只、扶正化瘀膠囊干預(yù)組24只。對(duì)照組給予生理鹽水腹腔注射(0.2ml/100g),每周2次,共8周;模型組給予30％CCL4橄欖油腹腔注射(0.2ml/100g),每周2次,共8周;扶正化瘀膠囊干預(yù)組從造模開始起按0.2ml/100g體重(含扶正化瘀膠囊生藥0.046g/ml)給予扶正化

20、瘀膠囊藥液灌胃,每日1次,共8周。對(duì)照組于第4、6、8周末隨機(jī)取處死大鼠3只,其余兩組第4、6、8周末隨機(jī)取處死大鼠8只。留取實(shí)驗(yàn)大鼠血清檢測(cè)ALT、AST;留取部分肝組織置于凍存管放于-80℃冰箱凍存用于檢測(cè)羥脯氨酸及提取肝組織總RNA,逆轉(zhuǎn)錄.聚合酶鏈反應(yīng)法(RT-PCR)檢測(cè)大鼠肝組織JAK1、STAT3mRNA表達(dá);留取部分肝組織置于10％的中性福爾馬林固定,石蠟包埋,蘇木精-伊紅(HE)染色及Masson染色觀察肝組織病理學(xué)改

21、變;應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色法觀察肝組織JAK1、STAT3蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 1：實(shí)驗(yàn)大鼠一般情況:對(duì)照組大鼠精神、食欲良好,毛發(fā)整齊而有光澤,活撥好動(dòng),每周體重增加正常。模型組大鼠隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng),精神萎靡,食欲下降,體重增長(zhǎng)緩慢,毛色轉(zhuǎn)黃,失去光澤,個(gè)別變得易激惹,甚至個(gè)別出現(xiàn)腹腔積液。扶正化瘀方干預(yù)組精神、飲食可,毛色有光澤,較模型組癥狀輕。
　　 2：扶正化瘀方對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠肝血清ALT、AST

22、水平影響:模型組大鼠第4、6、8周末血清ALT水平分別為:72.38±4.25 U/L、143.67±8.97U/L、264.61±14.63U/L,均高于對(duì)照組(17.37±5.04 U/L),且各時(shí)間點(diǎn)之間均有明顯差異(P＜0.05);AST分別為:182.35±4.12±U/L、323.53±11.50U/L、501.04±24.15U/L,亦均高于對(duì)照組(19.20±4.93 U/L),且各時(shí)間點(diǎn)之間亦均有明顯差異(P＜0.05

23、)。扶正化瘀方干預(yù)組大鼠第4、6、8周末ALT分別為:58.02±9.02 U/L、104.00±13.12 U/L,、147.00±15.73U/L,均高于對(duì)照組(17.37±5.04 U/L),且各時(shí)間點(diǎn)之間均有明顯差異(P＜0.05);AST分別為:118.00±13.23U/L、228.49±13.01U/L、302.17±17.19 U/L,均高于對(duì)照組(19.20±4.93 U/L),且各時(shí)間點(diǎn)之間亦均有明顯差異(P＜0.0

24、5)。相同時(shí)間點(diǎn),與模型組相比,扶正化瘀方干預(yù)組ALT、AST水平均較低(P＜0.05)。
　　 3：實(shí)驗(yàn)大鼠肝組織中HYP水平檢測(cè):模型組第4、6、8周末肝組織中HYP(195.97±17.90、346.35±15.25、478.80±8.16)及扶正化瘀方干預(yù)組HYP(132.67±11.24、246.36±13.16、444.67±13.24ug/g)均高于對(duì)照組(114.26±18.72ug/g),P＜0.05;扶正化瘀

25、方干預(yù)組HYP水平明顯低于模型組。
　　 4：扶正化瘀方對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠肝組織病理學(xué)影響:
　　 肉眼觀察:對(duì)照組肝臟顏色鮮紅,有光澤,表面光滑,邊緣銳利,與周圍組織無粘連,質(zhì)地軟而脆,觸之易碎。模型組4和6周末體積多無明顯改變,部分稍有增大,呈淺黃色,表面有脂肪組織附著,易剝離,肝臟邊緣變鈍,質(zhì)地較韌,不易碎,切面油膩;8周末體積多無明顯改變,部分稍有減小,顏色暗紅,表面有泥沙樣結(jié)節(jié),多與大網(wǎng)膜粘連,不易分離,肝臟邊緣明顯變

26、鈍,觸之稍硬,不易碎。扶正化瘀方干預(yù)組肝臟外觀好于模型組。
　　 HE及Masson膠原染色:對(duì)照組肝組織肝小葉結(jié)構(gòu)正常,肝索排列整齊,無炎性壞死及纖維組織增生(Fig1,Fig8)。模型組4周時(shí)肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂,肝細(xì)胞出現(xiàn)水樣變及脂肪變,可見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及纖維組織輕度的增生,匯管區(qū)擴(kuò)大;干預(yù)組可見肝細(xì)胞輕度水樣變及脂肪變,匯管區(qū)有少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),輕微的纖維組織增生(Fig2,Fig3,Fig9,Fig10)。6周時(shí)肝細(xì)胞呈彌漫

27、性脂肪變性,伴以單核細(xì)胞為主的混合性炎細(xì)胞浸潤(rùn),部分肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞,纖維組織增生:干預(yù)組部分肝細(xì)胞脂肪變性,伴點(diǎn)、灶狀壞死,纖維組織輕度增生,匯管區(qū)可見大量混合性炎細(xì)胞浸潤(rùn)(Fig4,Fig5,Fig11,Figl2)。8周模型組肝小葉結(jié)構(gòu)大部分破壞,炎細(xì)胞浸潤(rùn)廣泛浸潤(rùn),纖維組織廣泛增生,有假小葉形成;干預(yù)組部分肝小葉結(jié)構(gòu)破壞,纖維組織增生,炎性細(xì)胞浸潤(rùn),有假小葉形成,匯管區(qū)擴(kuò)大,可見小膽管增生及炎細(xì)胞滲出(Fig6,Fig7,Fig

28、13,Fig14)。
　　 5：扶正化瘀方對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠肝組織JAKl和STAT3蛋白表達(dá)情況的影響:對(duì)照組肝組織中僅有少量陽性細(xì)胞分布。模型組隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng),肝組織中JAK1和STAT3陽性表達(dá)逐漸增多;干預(yù)組JAK1和STAT3陽性表達(dá)細(xì)胞較對(duì)照增加,但明顯少于同時(shí)間段模型組。第4、6、8周末模型組JAK1和STAT3陽性光密度值(0.55±0.02、1.23±0.15、2.73±0.17)(0.82±0.03、1.53±0

29、.11、2.89±0.13)及干預(yù)組JAK1和STAT3陽性光密度值(0.48±0.06、0.86±0.16、1.65±0.10)(0.57±0.04、1.12±0.12、1.90±0.08)均顯著高于對(duì)照組(0.21±0.04)、(0.24±0.06),P＜0.05;扶正化瘀方干預(yù)組肝組織JAK1和STAT3蛋白表達(dá)明顯低于模型組(Fig22-Fig28)。
　　 6：扶正化瘀方對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠肝組織JAK1和STAT3 mRNA的

30、動(dòng)態(tài)表達(dá)的影響:模型組第4、6、8周末肝組織JAK1和STAT3 mRNA表達(dá)量分別為(0.76±0.04、1.54±0.06、2.48±0.03)、(0.81±0.09、1.65±0.07、2.66±0.10),扶正化瘀干預(yù)組第4、6、8周末肝組織JAK1和STAT3 mRNA表達(dá)量分別為(0.52±0.06、0.96±0.12、1.52±0.14)、(0.62±0.02、1.05±0.10、1.64±0.11)均高于對(duì)照組(0.33

31、±0.08)、(0.42±0.02),P＜0.05;且各組相同時(shí)間點(diǎn)之間均有明顯差異(P＜0.05),扶正化瘀干預(yù)組肝組織JAK1和STAT3 mRNA的表達(dá)明顯低于模型組(Fig29)。
　　 結(jié)論:
　　 1：扶正化瘀可明顯改善肝功能、炎癥壞死及肝組織纖維程度,具有預(yù)防和治療肝纖維化的作用。
　　 2：扶正化瘀可明顯抑制肝纖維化通路JAK1/STAT3mRNA及蛋白的表達(dá),降低肝組織的炎癥壞死,減輕肝纖維化的