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文檔簡介
1、目的和意義:探討保肝寧抗肝纖維化的分子機制,為保肝寧應用于臨床提供充分的理論依據(jù),為開發(fā)抗肝纖維化新藥保肝寧奠定堅實的理論基礎(chǔ)。 研究方法:以復合因素誘導的肝纖維化模型大鼠為研究對象,觀察保肝寧(方藥由黃芪、桃仁、丹參、黃芩、鱉甲等組成)對模型大鼠瘦素及其信號轉(zhuǎn)導通路的影響。 50只Wistar大鼠隨機分為5組,即正常對照組(A組)、模型組(B組)、秋水仙堿組(C組)、保肝寧大劑量組(D組)、保肝寧中劑量組(E組)。除A
2、組外,其余大鼠于實驗第1d每只皮下注射40%(體積分數(shù))CCl<,4>花生油0.5ml·100g<'-1>;以后每3日注射0.3ml·100g<'-1>。除A組外,各組均以普通飼料喂養(yǎng),并以5%乙醇為飲料。A組注射等量花生油,進食普通飼料并自由飲水。各組從造模第2天開始,每日給相應藥物灌胃,C組每日灌服秋水仙堿0.011mg·100g<'-1>,D、E組分別每日灌服保肝寧3.54g·100g<'-1>、1.77g·100g<'-1>,B
3、組及A組灌以等量蒸餾水作對照。第6周末,處死動物,取血和肝組織備用。取新鮮肝組織梯度置于-70℃中保存,用于蛋白印跡實驗(Western blotting analysis):一部分肝組織固定于10%中性福爾馬林溶液,肝組織常規(guī)脫水,石蠟包埋,切片厚5μm,做光鏡觀察和免疫組化用;血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)活性;總膽固醇(TC)、甘油三脂(TG)采用全自動生化分析儀檢測;放免法測定血清瘦素(Leptin)水平;光學顯
4、微鏡下觀察肝組織病理學變化;免疫組織化學技術(shù)檢測瘦素(Leptin)及瘦素受體(OB-Rb)等的表達水平;應用蛋白印跡試驗(Western blotting analysis)檢測瘦素受體(OB-Rb),JAK2(Janus激酶,Janus kinase)和轉(zhuǎn)錄活化因子(STAT3)蛋白的表達水平以及它們的磷酸化水平。統(tǒng)計學處理:計量資料用平均值±標準差(x±s)表示,數(shù)據(jù)處理采用SPSS14.0統(tǒng)計軟件包進行單因素方差分析(one-w
5、ay ANOVA)。 研究內(nèi)容和過程: 1.觀察保肝寧對模型大鼠的癥狀、體征及肝、脾指數(shù)的影響模型組大鼠精神不振、消瘦、厭食,飲水減少,大便稀溏,小便色黃而少;肝臟表面較正常組欠光滑,顏色淺,邊緣鈍,質(zhì)地硬,部分標本表面凹凸不平,呈小結(jié)節(jié)狀;脾臟明顯腫大,呈暗紅色。各藥物組大鼠精神狀態(tài)、毛色澤、飲食飲水、排便等一般情況均明顯改善,以保肝寧各組改善情況為佳。在增加體重方面,與模型組比較,秋水仙堿、保肝寧大、中劑量均能顯著增
6、加大鼠體重(P<0.05、P<0.01、P<0.01);各藥物組比較差異無顯著性意義(p>0.05)。各藥物組大鼠肝臟表面較光滑,顏色較紅;脾臟與正常組大鼠相比較無明顯差異。與正常組比較,模型組、各藥物組肝指數(shù)均明顯增加,差異有非常顯著性意義(P均<0.01),模型組脾臟指數(shù)亦明顯升高,差異有非常顯著性意義(P均<0.01);與模型組比較,各藥物組均能顯著降低模型大鼠肝、脾指數(shù),差異有顯著性意義(P均<0.01);其中,保肝寧大劑量組降
7、低肝指數(shù)的作用明顯優(yōu)于秋水仙堿組,差異有顯著性意義(p<0.05)。 2.觀察保肝寧對肝纖維化大鼠肝組織形態(tài)學的影響光鏡觀察顯示:模型組正常肝小葉結(jié)構(gòu)破壞,肝索排列紊亂,可見肝細胞點狀壞死,肝細胞空泡變性散在分布,間質(zhì)增生明顯,膠原纖維構(gòu)成的纖維間隔形成,形成較多完整的假小葉。各藥物組肝小葉樣結(jié)構(gòu)明顯改善,膠原纖維間隔較少,肝細胞壞死、炎性細胞浸潤少見,但極少數(shù)大鼠仍有不完全性假小葉。 3.保肝寧對模型大鼠血清肝功能、血
8、脂的影響與正常組比較,模型組血清ALT、AST、AST/ALT比值均明顯升高(P均<0.01),各藥物組ALT、AST水平亦明顯升高(P均<0.01);與模型組比較,各藥物組血清ALT、AST活性明顯下降,差異有非常顯著性意義(P均<0.01),保肝寧中劑量組AST/ALT比值也明顯下降,差異有顯著性意義(P<0.05);保肝寧大劑量組降低AST作用明顯優(yōu)于秋水仙堿(P<0.05)。與正常組比較,模型組及各藥物組血清TC、TG水平明顯下
9、降,差異有非常顯著性意義(P<0.01);與模型組比較,保肝寧大、中劑量組血清TC、TG水平明顯升高,差異有非常顯著性意義(P均<0.01)。其中,保肝寧大劑量升高TC作用明顯明顯優(yōu)于秋水仙堿組(P<0.05),保肝寧大、中劑量組升高TG作用均明顯優(yōu)于秋水仙堿組(P均<0.05)。 4.保肝寧對模型大鼠血清瘦素(Leptin)水平的影響與正常組比較,模型組及各藥物組血清Leptin水平明顯升高,差異有非常顯著性意義(P<0.01
10、);與模型組比較,各藥物組則明顯下降(P<0.01、P<0.01、P<0.05);各藥物組降低Leptin作用,差異無顯著性意義(P>0.05)。 5.保肝寧對肝纖維化大鼠肝組織瘦素(Leptin)及瘦素受體(OB-Rb)的影響 (1)Leptin的表達:正常組肝細胞內(nèi)呈陰性或極弱陽性表達,偶見于匯管區(qū)、小葉中央靜脈周圍及肝索DiSSO腔間隙中。模型組肝內(nèi)Leptin表達明顯增強,數(shù)目增多,呈棕黃色胞質(zhì)型分布;小葉中央靜
11、脈周圍、匯管區(qū)及肝小葉內(nèi)均有大量條索狀、星芒狀瘦素陽性表達,高倍鏡下,陽性表達主要分布于HSC胞質(zhì)中。各藥物組陽性染色程度較模型組明顯減輕,陽性細胞數(shù)目減少。統(tǒng)計學顯示,與正常組比較,模型組、各藥物組Leptin表達明顯增多,差異有非常顯著性意義(P<0.01);與模型組比較,各藥物組均可以降低Leptin的表達,差異有顯著性意義(p<0.01);各藥物組兩兩比較差異無顯著性意義(P>0.05)。 (2)0B-Rb表達:正常組肝
12、細胞內(nèi)呈陰性或極弱陽性表達,偶見于匯管區(qū)、小葉中央靜脈周圍及肝索DiSSO腔間隙中。模型組肝內(nèi)表達明顯增強,數(shù)目增多,呈棕黃色胞質(zhì)型分布;高倍鏡下,陽性表達主要分布于非實質(zhì)細胞(包括肝星狀細胞、竇內(nèi)皮細胞、枯否細胞等)胞質(zhì)及胞膜上,部分可定位于核。統(tǒng)計學顯示,與正常組比較,模型組、各藥物組0B-Rb表達明顯增多,差異有顯著性意義(P均<0.01);與模型組比較,各藥物組OB-Rb表達均無明顯變化,差異無顯著性意義(P均>0.05);各藥
13、物組0B-Rb的表達兩兩比較差異無顯著性意義(P>0.05)。 6.保肝寧對肝纖維化大鼠肝組織瘦素受體(OB-Rb)及其JAK2-STAT3信號轉(zhuǎn)導通路的影響 (1)OB-Rb、JAK2、STAT3蛋白表達。用Western Blot法檢測肝臟組織細胞內(nèi)OB-Rb、JAK2、STAT3蛋白表達情況,正常組蛋白表達量最少,保肝寧和秋水仙堿處理組蛋白條帶顏色均較淺,模型組條帶顏色最深。與正常組比較,模型組、保肝寧大、中劑量組
14、和秋水仙堿組OB-Rb、JAK2、STAT3蛋白程度均增高;與模型組相比,各藥物組的OB-Rb、JAK2、STAT3蛋白表達顯著降低;保肝寧大、中劑量組和秋水仙堿組相比,OB-Rb、JAK2、STAT3蛋白顯著降低。 (2)JAK2、STAT3蛋白磷酸化水平。用Western Blot法檢測肝臟組織細胞內(nèi)JAK2、STAT3蛋白磷酸化水平,正常組蛋白磷酸化水平最低,保肝寧和秋水仙堿處理組蛋白條帶顏色均較淺,模型組條帶顏色最深。與
15、正常組比較,模型組、各藥物組P-JAK2、P-STAT3蛋白表達水平均增高;與模型組相比,各藥物組的P-JAK2、P-STAT3蛋白表達顯著降低;保肝寧大、中劑量組和秋水仙堿組相比,P-JAK2、P-STAT3蛋白水平顯著降低。 結(jié)論:保肝寧能有效的阻止模型大鼠肝纖維化進程,其作用機制為: 1.保肝寧可以有效的改善肝纖維化模型大鼠的一般情況:如改善模型大鼠的精神狀況,增加體重,改善食欲和飲水等癥狀,提高大鼠生存質(zhì)量;顯著
16、降低模型大鼠肝、脾指數(shù)。 2.形態(tài)學觀察表明保肝寧能明顯改善破壞的肝小葉結(jié)構(gòu),減輕纖維組織增生;明顯減少膠原纖維間隔、肝細胞壞死以及炎性細胞的浸潤等。 3.保肝寧明顯降低纖維化模型大鼠血清ALT、AST含量,TG、TC水平明顯升高,提示保肝寧能有效減輕炎癥反應,調(diào)節(jié)血脂水平,保護肝細胞,從而抑制早期肝纖維化的啟動。 4.保肝寧明顯降低纖維化模型大鼠血清Leptin水平,有效的阻止了Leptin與OB-Rb結(jié)合而發(fā)
17、揮的誘導HSC活化和增殖作用。 5.保肝寧明顯抑制纖維化模型大鼠肝組織Leptin的表達,明顯減輕Leptin陽性染色程度,減少陽性細胞數(shù)目,提示Leptin是保肝寧抗肝纖維化的作用靶點之一。 6.保肝寧有效抑制纖維化模型大鼠肝組織OB-Rb以及其信號轉(zhuǎn)導分子JAK2、STAT3的蛋白表達,顯著降低JAK2、STAT3蛋白磷酸化水平,提示保肝寧具有抑制OB-Rb及其信號轉(zhuǎn)導作用,這可能是其抗肝纖維化的分子機制之一。
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