瘦素調(diào)控大鼠肝纖維化的信號轉(zhuǎn)導機制及保肝寧的干預作用.pdf

1、目的和意義：探討保肝寧抗肝纖維化的分子機制，為保肝寧應用于臨床提供充分的理論依據(jù)，為開發(fā)抗肝纖維化新藥保肝寧奠定堅實的理論基礎(chǔ)。 研究方法：以復合因素誘導的肝纖維化模型大鼠為研究對象，觀察保肝寧(方藥由黃芪、桃仁、丹參、黃芩、鱉甲等組成)對模型大鼠瘦素及其信號轉(zhuǎn)導通路的影響。 50只Wistar大鼠隨機分為5組，即正常對照組(A組)、模型組(B組)、秋水仙堿組(C組)、保肝寧大劑量組(D組)、保肝寧中劑量組(E組)。除A

2、組外，其余大鼠于實驗第1d每只皮下注射40％(體積分數(shù))CCl<,4>花生油0.5ml·100g<'-1>；以后每3日注射0.3ml·100g<'-1>。除A組外，各組均以普通飼料喂養(yǎng)，并以5％乙醇為飲料。A組注射等量花生油，進食普通飼料并自由飲水。各組從造模第2天開始，每日給相應藥物灌胃，C組每日灌服秋水仙堿0.011mg·100g<'-1>，D、E組分別每日灌服保肝寧3.54g·100g<'-1>、1.77g·100g<'-1>，B

3、組及A組灌以等量蒸餾水作對照。第6周末，處死動物，取血和肝組織備用。取新鮮肝組織梯度置于-70℃中保存，用于蛋白印跡實驗(Western blotting analysis)：一部分肝組織固定于10％中性福爾馬林溶液，肝組織常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片厚5μm，做光鏡觀察和免疫組化用；血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)活性；總膽固醇(TC)、甘油三脂(TG)采用全自動生化分析儀檢測；放免法測定血清瘦素(Leptin)水平；光學顯

4、微鏡下觀察肝組織病理學變化；免疫組織化學技術(shù)檢測瘦素(Leptin)及瘦素受體(OB-Rb)等的表達水平；應用蛋白印跡試驗(Western blotting analysis)檢測瘦素受體(OB-Rb)，JAK2(Janus激酶，Janus kinase)和轉(zhuǎn)錄活化因子(STAT3)蛋白的表達水平以及它們的磷酸化水平。統(tǒng)計學處理：計量資料用平均值±標準差(x±s)表示，數(shù)據(jù)處理采用SPSS14.0統(tǒng)計軟件包進行單因素方差分析(one-w

5、ay ANOVA)。 研究內(nèi)容和過程： 1．觀察保肝寧對模型大鼠的癥狀、體征及肝、脾指數(shù)的影響模型組大鼠精神不振、消瘦、厭食，飲水減少，大便稀溏，小便色黃而少；肝臟表面較正常組欠光滑，顏色淺，邊緣鈍，質(zhì)地硬，部分標本表面凹凸不平，呈小結(jié)節(jié)狀；脾臟明顯腫大，呈暗紅色。各藥物組大鼠精神狀態(tài)、毛色澤、飲食飲水、排便等一般情況均明顯改善，以保肝寧各組改善情況為佳。在增加體重方面，與模型組比較，秋水仙堿、保肝寧大、中劑量均能顯著增

6、加大鼠體重(P<0.05、P<0.01、P<0.01)；各藥物組比較差異無顯著性意義(p>0.05)。各藥物組大鼠肝臟表面較光滑，顏色較紅；脾臟與正常組大鼠相比較無明顯差異。與正常組比較，模型組、各藥物組肝指數(shù)均明顯增加，差異有非常顯著性意義(P均<0.01)，模型組脾臟指數(shù)亦明顯升高，差異有非常顯著性意義(P均<0.01)；與模型組比較，各藥物組均能顯著降低模型大鼠肝、脾指數(shù)，差異有顯著性意義(P均<0.01)；其中，保肝寧大劑量組降

7、低肝指數(shù)的作用明顯優(yōu)于秋水仙堿組，差異有顯著性意義(p<0.05)。 2．觀察保肝寧對肝纖維化大鼠肝組織形態(tài)學的影響光鏡觀察顯示：模型組正常肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，肝索排列紊亂，可見肝細胞點狀壞死，肝細胞空泡變性散在分布，間質(zhì)增生明顯，膠原纖維構(gòu)成的纖維間隔形成，形成較多完整的假小葉。各藥物組肝小葉樣結(jié)構(gòu)明顯改善，膠原纖維間隔較少，肝細胞壞死、炎性細胞浸潤少見，但極少數(shù)大鼠仍有不完全性假小葉。 3．保肝寧對模型大鼠血清肝功能、血

8、脂的影響與正常組比較，模型組血清ALT、AST、AST/ALT比值均明顯升高(P均<0.01)，各藥物組ALT、AST水平亦明顯升高(P均<0.01)；與模型組比較，各藥物組血清ALT、AST活性明顯下降，差異有非常顯著性意義(P均<0.01)，保肝寧中劑量組AST/ALT比值也明顯下降，差異有顯著性意義(P<0.05)；保肝寧大劑量組降低AST作用明顯優(yōu)于秋水仙堿(P<0.05)。與正常組比較，模型組及各藥物組血清TC、TG水平明顯下

9、降，差異有非常顯著性意義(P<0.01)；與模型組比較，保肝寧大、中劑量組血清TC、TG水平明顯升高，差異有非常顯著性意義(P均<0.01)。其中，保肝寧大劑量升高TC作用明顯明顯優(yōu)于秋水仙堿組(P<0.05)，保肝寧大、中劑量組升高TG作用均明顯優(yōu)于秋水仙堿組(P均<0.05)。 4．保肝寧對模型大鼠血清瘦素(Leptin)水平的影響與正常組比較，模型組及各藥物組血清Leptin水平明顯升高，差異有非常顯著性意義(P<0.01

10、)；與模型組比較，各藥物組則明顯下降(P<0.01、P<0.01、P<0.05)；各藥物組降低Leptin作用，差異無顯著性意義(P>0.05)。 5．保肝寧對肝纖維化大鼠肝組織瘦素(Leptin)及瘦素受體(OB-Rb)的影響 (1)Leptin的表達：正常組肝細胞內(nèi)呈陰性或極弱陽性表達，偶見于匯管區(qū)、小葉中央靜脈周圍及肝索DiSSO腔間隙中。模型組肝內(nèi)Leptin表達明顯增強，數(shù)目增多，呈棕黃色胞質(zhì)型分布；小葉中央靜

11、脈周圍、匯管區(qū)及肝小葉內(nèi)均有大量條索狀、星芒狀瘦素陽性表達，高倍鏡下，陽性表達主要分布于HSC胞質(zhì)中。各藥物組陽性染色程度較模型組明顯減輕，陽性細胞數(shù)目減少。統(tǒng)計學顯示，與正常組比較，模型組、各藥物組Leptin表達明顯增多，差異有非常顯著性意義(P<0.01)；與模型組比較，各藥物組均可以降低Leptin的表達，差異有顯著性意義(p<0.01)；各藥物組兩兩比較差異無顯著性意義(P>0.05)。 (2)0B-Rb表達：正常組肝

12、細胞內(nèi)呈陰性或極弱陽性表達，偶見于匯管區(qū)、小葉中央靜脈周圍及肝索DiSSO腔間隙中。模型組肝內(nèi)表達明顯增強，數(shù)目增多，呈棕黃色胞質(zhì)型分布；高倍鏡下，陽性表達主要分布于非實質(zhì)細胞(包括肝星狀細胞、竇內(nèi)皮細胞、枯否細胞等)胞質(zhì)及胞膜上，部分可定位于核。統(tǒng)計學顯示，與正常組比較，模型組、各藥物組0B-Rb表達明顯增多，差異有顯著性意義(P均<0.01)；與模型組比較，各藥物組OB-Rb表達均無明顯變化，差異無顯著性意義(P均>0.05)；各藥

13、物組0B-Rb的表達兩兩比較差異無顯著性意義(P>0.05)。 6．保肝寧對肝纖維化大鼠肝組織瘦素受體(OB-Rb)及其JAK2-STAT3信號轉(zhuǎn)導通路的影響 (1)OB-Rb、JAK2、STAT3蛋白表達。用Western Blot法檢測肝臟組織細胞內(nèi)OB-Rb、JAK2、STAT3蛋白表達情況，正常組蛋白表達量最少，保肝寧和秋水仙堿處理組蛋白條帶顏色均較淺，模型組條帶顏色最深。與正常組比較，模型組、保肝寧大、中劑量組

14、和秋水仙堿組OB-Rb、JAK2、STAT3蛋白程度均增高；與模型組相比，各藥物組的OB-Rb、JAK2、STAT3蛋白表達顯著降低；保肝寧大、中劑量組和秋水仙堿組相比，OB-Rb、JAK2、STAT3蛋白顯著降低。 (2)JAK2、STAT3蛋白磷酸化水平。用Western Blot法檢測肝臟組織細胞內(nèi)JAK2、STAT3蛋白磷酸化水平，正常組蛋白磷酸化水平最低，保肝寧和秋水仙堿處理組蛋白條帶顏色均較淺，模型組條帶顏色最深。與

15、正常組比較，模型組、各藥物組P-JAK2、P-STAT3蛋白表達水平均增高；與模型組相比，各藥物組的P-JAK2、P-STAT3蛋白表達顯著降低；保肝寧大、中劑量組和秋水仙堿組相比，P-JAK2、P-STAT3蛋白水平顯著降低。 結(jié)論：保肝寧能有效的阻止模型大鼠肝纖維化進程，其作用機制為： 1．保肝寧可以有效的改善肝纖維化模型大鼠的一般情況：如改善模型大鼠的精神狀況，增加體重，改善食欲和飲水等癥狀，提高大鼠生存質(zhì)量；顯著

16、降低模型大鼠肝、脾指數(shù)。 2．形態(tài)學觀察表明保肝寧能明顯改善破壞的肝小葉結(jié)構(gòu)，減輕纖維組織增生；明顯減少膠原纖維間隔、肝細胞壞死以及炎性細胞的浸潤等。 3．保肝寧明顯降低纖維化模型大鼠血清ALT、AST含量，TG、TC水平明顯升高，提示保肝寧能有效減輕炎癥反應，調(diào)節(jié)血脂水平，保護肝細胞，從而抑制早期肝纖維化的啟動。 4．保肝寧明顯降低纖維化模型大鼠血清Leptin水平，有效的阻止了Leptin與OB-Rb結(jié)合而發(fā)

17、揮的誘導HSC活化和增殖作用。 5．保肝寧明顯抑制纖維化模型大鼠肝組織Leptin的表達，明顯減輕Leptin陽性染色程度，減少陽性細胞數(shù)目，提示Leptin是保肝寧抗肝纖維化的作用靶點之一。 6．保肝寧有效抑制纖維化模型大鼠肝組織OB-Rb以及其信號轉(zhuǎn)導分子JAK2、STAT3的蛋白表達，顯著降低JAK2、STAT3蛋白磷酸化水平，提示保肝寧具有抑制OB-Rb及其信號轉(zhuǎn)導作用，這可能是其抗肝纖維化的分子機制之一。