“濁毒”立論的化濁解毒方經(jīng)JAK-STAT通路對大鼠肝纖維化的作用研究.pdf

1、目的:肝纖維化(hepaticfibrosis，HF)是一種高發(fā)病率的醫(yī)學(xué)性難題，是多種慢性肝病演進、發(fā)展的共同病理過程，其演變結(jié)果為肝硬化。目前，普遍認為肝硬化是不可逆轉(zhuǎn)的，而肝纖維化是可以逆轉(zhuǎn)的。故而尋求抗肝纖維化的有效藥物，成為當(dāng)今治療肝病的研究重點。臨床上現(xiàn)治療肝纖維化方面尚缺乏公認有效的手段，而中醫(yī)藥憑借多層次、多靶點的治療特點顯示了其獨特的療效。導(dǎo)師李佃貴教授首次提出并創(chuàng)立“濁毒”理論，經(jīng)多年的臨床實踐，李教授認為“濁毒”是

2、肝纖維化形成的關(guān)鍵因素，以化濁解毒法為治療原則組方取得了滿意的臨床效果，但化濁解毒方的作用機制尚不明確。目前證實，肝星狀細胞(hepaticstellatecell，HSC)是致肝纖維化的主要細胞，血小板衍生生長因子（Plateletderivedgrowthfactor,PDGF）是目前已知的對HSC作用最強的有絲分裂原。JAK激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活子通路(januskinase/signaltransducerandactivat

3、oroftranscription，JAK/STAT)是多種細胞因子的傳導(dǎo)通路，與肝纖維化形成過程密切相關(guān)。本實驗通過觀察化濁解毒方對PDGF-BB、JAK2/STAT3的表達情況，來判斷其對大鼠肝纖維化的干預(yù)作用，進而探討化濁解毒方對肝纖維化的可能作用機制，為化濁解毒方治療肝纖維化提供現(xiàn)代藥理學(xué)靶點，從以方測證的角度為化濁解毒法提供分子生物學(xué)依據(jù)。
　　 方法:清潔級SD雄性大鼠70只，體重200±20g，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后隨機

4、分為6組。即:正常對照組(N)，n=10只;模型對照組(DMN)，n=20只;化濁解毒方高劑量組(H)，n=10只、化濁解毒方中劑量組(M)，n=10只、化濁解毒方低劑量組(L)，n=10只;復(fù)方鱉甲軟肝片組(BJ)，n=10只，各組大鼠均正常飲食。除正常對照組外，各組大鼠均于每周一上午開始予腹腔內(nèi)注射10mg/kg的1％DMN，1次/天。實驗第1周連續(xù)造模3天;第2到6周，每周連續(xù)造模2天;在造模的第2、4周末分別處死模型組大鼠4只，

5、觀察肝組織及病理切片纖維化程度，至第4周末，大鼠中度肝纖維化模型建成;第5到8周，每天等體積灌胃給與不同藥物。第8周末，所有大鼠處死并取新鮮肝組織，運用蘇木精-伊紅染色觀察肝組織病理情況;運用RT-PCR法檢測肝組織中PDGF-BB、JAK2/STAT3mRNA的表達情況。
　　 結(jié)果:
　　 1各組大鼠的一般情況
　　 實驗期間，模型對照組大鼠死亡3只，給予高劑量化濁解毒方的大鼠死亡2只，余組大鼠無死亡情況。正

6、常對照組大鼠一般情況好，進食正常，活動敏捷，毛色有光澤，體重穩(wěn)步增加，大便呈顆粒狀。其余各組大鼠均有不同程度的進食減少，精神萎靡、嗜睡，皮毛晦暗，體重減輕，便溏。
　　 2肝組織及病理學(xué)情況觀察
　　 肉眼觀察正常對照組大鼠肝臟表面光滑、質(zhì)韌，色鮮紅;模型對照組大鼠肝臟表面有顆粒狀結(jié)節(jié)，質(zhì)硬，色晦暗;中劑量化濁解毒方受試大鼠肝臟表面散在細砂粒樣結(jié)節(jié)，質(zhì)稍硬，色暗紅。HE染色情況顯示:正常對照組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝索排列

7、整齊;模型組肝小葉結(jié)構(gòu)破壞明顯，纖維組織增粗、分割肝小葉;給予中劑量化濁解毒方的大鼠較模型組肝小葉結(jié)構(gòu)破壞明顯減輕，纖維條索變細。
　　 3RT-PCR結(jié)果
　　 3.1PDGF-BBmRNA表達:正常對照組中可以檢測到少量PDGF-BBmRNA的表達。與正常對照組比較，模型對照組PDGF-BBmRNA的表達顯著增加（P＜0.01）;復(fù)方鱉甲軟肝片組及低劑量的化濁解毒方PDGF-BBmRNA水平均較模型對照組降低，差異具

8、有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);中劑量的化濁解毒方與模型對照組相比，PDGF-BB顯著降低，差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);高劑量的化濁解毒方和模型對照組比較，PDGF-BBmRNA的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 3.2JAK2mRNA表達:正常對照組中可以檢測到少量JAK2mRNA的表達。與正常對照組對比，模型對照組JAK2mRNA的表達顯著增加(P＜0.01);低劑量的化濁解毒方JAK2mRNA水平均較

9、模型對照組降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);復(fù)方鱉甲軟肝片組及中劑量的化濁解毒方與模型對照組相比JAK2mRNA顯著降低，差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);高劑量的化濁解毒方和模型對照組比較，JAK2mRNA的表達與模型組均處于較高水平表達，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 3.3STAT3mRNA的表達:正常對照組中有少量STAT3mRNA的表達。與正常對照組相比，模型對照組STAT3mRNA的表達顯著增加(P＜0.01

10、)。復(fù)方鱉甲軟肝片組STAT3mRNA的水平較模型組降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）;其它組較模型對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。
　　 結(jié)論:
　　 1在DMN致大鼠肝纖維化的模型中，細胞因子PDGF-BB及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路JAK2/STAT3表達上調(diào)，是參與形成肝纖維化的機制之一。
　　 2化濁解毒方能夠改善DMN所致大鼠肝纖維化的程度，降低大鼠肝組織中PDGF-BB和JAK2的mRNA表達