JAK-STAT信號轉導通路在局灶性腦缺血再灌注損傷中作用的研究.pdf

1、研究目的 1．探索腦缺血再灌注損傷后JAK2、STAT3激活及變化規(guī)律。 2．探索腦缺血再灌注損傷后JAK2/STAT3活化是否通過介導Caspase-3引起神經(jīng)細胞死亡。 3．利用JAK2特異性抑制劑及抗氧化劑阻斷JAK2/STAT3異常激活，觀察其對腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能缺損、腦梗死面積、促凋亡基因及細胞凋亡等影響。探討JAK2、STAT3異常激活在腦缺血神經(jīng)細胞凋亡間中的作用。 本實驗分三部分探討

2、JAK/STAT信號轉導通路在局灶性腦缺血再灌注損傷中作用的研究 第一部分大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷后磷酸化JAK2/STAT3蛋白表達及細胞凋亡的研究 采用大腦中動脈線栓法制作大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型，觀察磷酸化JAK2、磷酸化STAT3蛋白在局灶性腦缺血再灌注損傷后的表達及細胞凋亡的變化規(guī)律。 方法 1．健康成年雄性SD大鼠，體質量250-300g。動物隨機分為假手術對照組、腦缺血2 h再灌注3

3、 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、168 h組，每組10只動物。 2．采用改良大腦中動脈線栓法制作大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型。 3．各組按照不同時間點(再灌注3 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、168 h)麻醉，經(jīng)左心室-升主動脈插管，灌注生理鹽水、4％多聚甲醛。斷頭取腦。腦組織行冰凍切片，分別用H.E染色、免疫組織化學、TUNEL法檢測磷酸化JAK2、磷酸化STAT3免疫陽性

4、細胞及凋亡細胞，計數(shù)各組磷酸化JAK2、磷酸化STAT3免疫陽性細胞及凋亡細胞。 4．采用Western blotting檢測缺血側腦組織磷酸化JAK2、磷酸化STAT3蛋白表達情況。 結果 1．假手術大鼠、腦缺血再灌注損傷3 h組大鼠腦組織未見P-JAK2、P-STAT3蛋白陽性表達信號，腦缺血再灌注損傷6 h組大鼠缺血側腦組織可見少量P-JAK2、P-STAT3免疫陽性細胞，12 h陽性表達開始增強，24 h

5、達高峰，以缺血半暗帶區(qū)最明顯，隨再灌注時間延長，以后逐漸下降，至168 h仍有表達。 2．腦缺血再灌注損傷后腦組織P-JAK2、P-STAT3 Western blotting檢測結果在分子量為131KD、92KD的位置上可以看到有特異的發(fā)光帶，假手術組未檢測到 P-JAK2、P-STAT3蛋白表達帶，腦缺血再灌注損傷3 h組可見少量表達，12 h表達水平開始增強，24 h達高峰，以后逐漸下降，168 h仍有少量表達。

6、3．假手術組、手術組大鼠的右側大腦半球未見明顯TUNEL陽性細胞，缺血再灌注3h偶見極少量的凋亡細胞，主要位于缺血中心區(qū)。缺血再灌注6h即有明顯特征凋亡細胞。隨著缺血再灌注時間延長，缺血灶周邊區(qū)凋亡細胞逐漸增加，24～48 h陽性細胞數(shù)達高峰，以后逐漸下降，TUNEL陽性細胞胞核染成棕褐色。 結論 腦缺血再灌注損傷能激活JAK2/STAT3信號轉導通路。腦缺血再灌注損傷后磷酸化JAK2、磷酸化STAT3蛋白表達明顯增強，

7、以缺血半暗帶區(qū)表達最明顯，再灌注24 h達高峰，之后開始下降。缺血再灌注損傷后凋亡細胞也顯著增多，再灌注24 h達高峰，凋亡細胞的變化與磷酸化JAK2、磷酸化STAT3蛋白表達變化一致。腦缺血再灌注損傷后引發(fā)JAK2、STAT3的活化及超量表達可能與神經(jīng)細胞生存與凋亡有關，JAK2/STAT3信號通路可能參與了腦缺血再灌注損傷與修復的病理生理過程。 第二部分信號轉導阻滯劑AG490對腦缺血再灌注損傷后腦組織JAK2/STAT3信

8、號轉導及細胞凋亡的影響 利用JAK2蛋白激酶的特異性磷酸化抑制劑AG490阻斷炎性介質的信號轉導，抑制JAK2/STAT3的激活，下調缺血后半暗帶區(qū)P-JAK2、P-STAT3的表達，觀察其對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)行為學、腦梗死體積、神經(jīng)細胞凋亡及凋亡調控基因caspase-3蛋白表達的影響，旨在進一步探討JAK2/STAT3信號轉導在局灶性腦缺血再灌注損傷中的作用及其機制。 方法 1．健康成年雄性SD

9、大鼠，體質量250-300g。動物隨機分為假手術組、腦缺血再灌注組、生理鹽水治療組、AG490治療組。治療組于腦缺血開始時及再灌注后12h分別腹腔注射AG490 1mg．kg<'-1>或等量生理鹽水。每組16只動物，每組6只用于TTC染色，6只用于免疫組化，4只用于Western blotting。 2．采用改良大腦中動脈線栓法制作大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型。 3．按經(jīng)典的Zea Longa法評定神經(jīng)功能缺損，TTC

10、染色檢測腦梗死體積。 4．取大鼠腦組織切片，經(jīng)免疫組織化學、TUNEL法檢測腦組織P-JAK2、P-STAT3、caspase-3的免疫陽性細胞及凋亡細胞。 5．采用Western blotting檢測缺血側腦組織磷酸化JAK2、磷酸化STAT3、caspase-3蛋白表達情況。 結果 1．AG490治療組神經(jīng)功能評分較低，腦梗死體積縮小，與模型組及生理鹽水治療對照組比較均有顯著性差異(P<0.05)。

11、 2．AG490治療組能明顯減少缺血再灌注損24小時缺血側腦組織P-JAK2、P．STAT3及caspase-3免疫陽性細胞；缺血側腦組織P-JAK2、P-STAT3及caspase-3蛋白表達顯著減少；缺血半暗帶區(qū)凋亡細胞數(shù)也顯著減少，與模型組及生理鹽水治療對照組比較均有顯著性差異(P<0.001)。 結論 腦缺血再灌注損傷早期給予JAK2蛋白激酶的磷酸化抑制劑AG490可以縮小腦梗死面積，改善神經(jīng)功能缺損。AG

12、490能有效阻斷JAK2/STAT3信號轉導通路的異常激活，部分阻斷炎性細胞因子的細胞內(nèi)信號轉導，進而影響其下游靶基因caspase-3，抑制缺血半暗帶區(qū)腦組織caspase-3蛋白表達上調，減少細胞凋亡的發(fā)生，減輕腦損傷。阻斷缺血后JAK2/STAT3異常激活具有神經(jīng)保護作用。JAK2/STAT3信號通路通過caspase-3激活介導腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)細胞凋亡。 第三部分抗氧化劑依達拉奉對腦缺血再灌注損傷后腦組織JAK2/

13、STAT3信號轉導及神經(jīng)細胞損傷的影響 采用大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型，觀察抗氧化劑依達拉奉是否能通過抑制與炎性細胞因子及氧化應激有密切關系的JAK2/STAT3信號轉導通路而起到神經(jīng)保護作用。 方法 1．健康成年雄性SD大鼠，體質量250-300g。動物隨機分為假手術組、腦缺血再灌注組、生理鹽水治療組、依達拉奉治療組。治療組于腦缺血開始時及再灌注后12h分別腹腔注射依達拉奉3mg．kg<'-1>或等量生理鹽

14、水。每組16只動物，每組6只用于TTC染色，6只用于免疫組化，4只用于Western blotting。 2．采用改良大腦中動脈線栓法制作大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型。 3．按經(jīng)典的Zea Longa法評定神經(jīng)功能缺損，TTC染色檢測腦梗死體積。 4．取大鼠腦組織切片，經(jīng)免疫組織化學、TUNEL法檢測腦組織P-JAK2、P-STAT3、caspase-3的免疫陽性細胞及凋亡細胞。 5，采用Western

15、 blotting檢測缺血側腦組織磷酸化JAK2、磷酸化STAT3、caspase-3蛋白表達情況。 結果 1．依達拉奉治療組能明顯減輕腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)功能缺損，縮小腦梗死體積，與模型組及生理鹽水治療對照組比較均有顯著性差異(P<0.01)。 2．缺血再灌注損24小時，依達拉奉治療組缺血側腦組織P-JAK2、P-STAT3及 caspase-3免疫陽性細胞較模型組及生理鹽水治療組顯著減少；P-JAK2、P-