MiRNA調(diào)控JAK-STAT信號(hào)通路在幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎發(fā)病中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、1.背景
　　幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎是兒童時(shí)期常見的慢性結(jié)締組織疾病以慢性關(guān)節(jié)滑膜炎為主要特征,可伴有全身多器官功能損害是造成小兒致殘和失明的重要原因。JIA的起病多較隱匿，目前診斷主要依靠臨床和影像學(xué)表現(xiàn)，缺乏特異和敏感的生物指標(biāo)物，同時(shí)JIA發(fā)病機(jī)制仍不清楚，從而為生物靶向治療帶來困難。
　　JIA的發(fā)病主要由于細(xì)胞免疫功能紊亂，目前認(rèn)為與IL-6/JAK/STAT通路異常激活息息相關(guān)。白介素6是活化的T細(xì)胞和成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的

2、細(xì)胞因子。能使B細(xì)胞前體成為產(chǎn)生抗體的細(xì)胞；和集落刺激因子協(xié)同，能促進(jìn)原始骨髓源細(xì)胞的生長和分化，調(diào)理免疫，增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞的裂解功能。作為一個(gè)炎癥因子，能調(diào)控內(nèi)環(huán)境功能，包括糖代謝和下丘腦垂體腎上腺素軸的調(diào)節(jié)?？梢砸鸢l(fā)熱，誘導(dǎo)急性期蛋白和提高外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)。Tocilizumab[2]是一種重組人源化抗人白介素6（IL-6）受體單克隆抗體，由中國倉鼠卵巢（CHO）細(xì)胞通過DNA重組技術(shù)制得。通過特異性的阻斷IL-6受體，降低JAK

3、/STAT3激活，可下調(diào)TH17細(xì)胞的生成，有利于緩解關(guān)節(jié)癥狀以及下調(diào)炎癥因子(TNF-α、IL-17等)的表達(dá)，從而控制病情進(jìn)展。那阻斷IL-6/JAK/STAT通路會(huì)對(duì)JIA急性病程及細(xì)胞免疫、體液免疫產(chǎn)生怎樣的影響？
　　目前JIA發(fā)病機(jī)制仍不明了，研究表明RA急性期p-STAT3/STAT3持續(xù)表達(dá)，而抑制STAT3轉(zhuǎn)錄因子會(huì)導(dǎo)致RA滑膜纖維原細(xì)胞凋亡，細(xì)胞基質(zhì)中有活性轉(zhuǎn)錄因子STAT3的RASF增值、抗凋亡和侵入能力均增

4、強(qiáng)[3]，同時(shí)，STAT3可在IL-6、IL-23等炎癥因子的刺激下磷酸化[4]，誘導(dǎo)滑膜成纖維細(xì)胞表達(dá)大量RANKL蛋白，從而促進(jìn)破骨細(xì)胞產(chǎn)生，繼而促進(jìn)關(guān)節(jié)破壞[5]。IL-6/JAK/STAT異常激活的原因是什么？
　　MicroRNA是一類非編碼單鏈RNA，廣泛存在于生命體中的一種正常調(diào)節(jié)機(jī)制，通過與靶mRNA的3′端非翻譯區(qū)(3′UTR)特異性結(jié)合，導(dǎo)致靶向mRNA降解或抑制其翻譯過程，參與細(xì)胞發(fā)育、細(xì)胞增殖、分化和細(xì)胞周

5、期等許多基本生物過程，還參與人類許多疾病的發(fā)病，包括癌癥、代謝疾病、神經(jīng)障礙、傳染病及自身免疫病[6]。目前國內(nèi)外已有多個(gè)研究表明多個(gè)miRNA，如miR-155[7]、 miR-146a[8]通過調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞如T、B細(xì)胞的增殖和分化參與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)生。雖然最近幾項(xiàng)隨機(jī)對(duì)照研究表明，不少的miRNA在RA患者滑膜成纖維細(xì)胞、外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)和T淋巴細(xì)胞均有不同程度的表達(dá)差異，其中包括miR-155, miR-19a, m

6、iR-203,miR-21，miR-124a[9-16]，但對(duì)其靶基因的分析及調(diào)控相關(guān)信號(hào)通路的機(jī)制仍不明了，同時(shí)，國內(nèi)外針對(duì)JIA生物標(biāo)記物相關(guān)的研究仍缺乏。這些miRNA是否參與JIA發(fā)病，是否與IL-6/JAK/STAT通路異常激活有關(guān)及如何產(chǎn)生影響，是否能夠?qū)ふ夷硞€(gè)miRNA作為JIA早期診斷及判斷急性炎癥的生物標(biāo)記物，我們將在下面研究進(jìn)一步探討。
　　2.目的
　　1.研究IL-6受體拮抗劑（Tocilizumab

7、）對(duì)兒童SJIA淋巴細(xì)胞亞群、免疫球蛋白及生化指標(biāo)的影響及總結(jié)其臨床療效及不良事件發(fā)生情況，以進(jìn)一步揭示IL-6對(duì)SJIA中的作用。
　　2.探討miRNA調(diào)控IL-6/JAK/STAT通路相關(guān)蛋白（STAT3/p-STAT3/SOCS3）在JIA發(fā)病中的分子免疫機(jī)制，以進(jìn)一步尋找JIA新型特異性生物標(biāo)記物及治療靶點(diǎn)。
　　3.方法:
　　1.回顧性分析2014年2月至2015年2月廣州市婦女兒童醫(yī)療中心免疫科24例S

8、JIA患兒的臨床特征,包括基線數(shù)據(jù)、實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果以及治療和不良反應(yīng)情況，根據(jù)是否使用 Tocilizumab分2組，12例予 Tocilizumab+激素+DMARDs為Tocilizumab組，12例予安慰劑+激素+DMARDs為對(duì)照組，觀察癥狀緩解情況，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)2組 SJIA用藥12周前后 CD3+/CD4+/CD8+T、CD19+B、CD16+56-NK細(xì)胞比例。對(duì)比2組患兒免疫球蛋白IgG、IgM、IgA、IgE用藥

9、前后的變化，并觀察連續(xù)用藥12周炎癥指標(biāo)（CRP、ESR、FER、WBC）及ALT/AST變化、不良反應(yīng)及激素減停情況進(jìn)行歸納分析
　　2.標(biāo)本采集分兩組病例組和對(duì)照組，病例組共33例活動(dòng)期JIA患兒，按分型分為全身型組20例，關(guān)節(jié)型組13例，正常對(duì)照組20例，采集外周血，F(xiàn)icoll法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC），提取和純化miRNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；通過Targetscan和RNA22共同預(yù)測(cè)靶基因，設(shè)計(jì)引物，miR-1

10、9a、miR-21以U6為內(nèi)參，STAT3、SOCS3、IL-6、TNF-αmRNA以β-Actin為內(nèi)參，應(yīng)用熒光定量PCR分別檢測(cè)其組間表達(dá)，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)化后的2-δδT值表示miRNA的相對(duì)表達(dá)含量，非參數(shù)檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)兩組數(shù)據(jù)2-δδT的差異。構(gòu)建miR-21慢病毒表達(dá)載體LV3-miR-21，轉(zhuǎn)染至RASFs，用濃度0.01ng/mlIL-6刺激4h，Western Blot檢測(cè)miR-21過表達(dá)組與對(duì)照組IL-6刺激前后p-STAT3

11、/STAT3/SOCS3和GADPH蛋白表達(dá)量，計(jì)算灰度值，統(tǒng)計(jì)差異。
　　4．結(jié)果:
　　1.托珠單抗+DMARDs組，治療12周后CRP、ESR、FER均明顯下降，托珠單抗組CD4+T、CD19+B細(xì)胞的比例較基線降低（P<0.05），CD8+、CD3+T細(xì)胞比例較基線升高、2組CD16+56-NK細(xì)胞較基線變化不明顯P>0.05，免疫球蛋白IgG、IgM、IgA較基線下降（P<0.05）。對(duì)照組均無顯著差異（P>0.0

12、5）。并發(fā)癥主要為上呼吸道感染，其次轉(zhuǎn)氨酶升高，膽固醇、脂蛋白代謝異常（低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、甘油三酯水平升高）；2組均未發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)（三系減少、重癥感染等）。
　　2.miR-19a、miR-21在病例組（全身型組和關(guān)節(jié)型在）均較對(duì)照組低表達(dá)（P<0.05），全身型組與關(guān)節(jié)型組間miR-21、miR-19a表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05），預(yù)測(cè)顯示與JAK/STAT通路相關(guān)的STAT3為miR-21、SOCS3

13、、TNF-α為miR-19a的靶基因， STAT3、SOCS3、TNF-α、IL-6 mRNA較對(duì)照組表達(dá)升高(p<0.05)。病例組（全身型組和關(guān)節(jié)型在）miR-21與STAT3 mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（p<0.05），miR-19a與TNF-α、SOCS3 mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(p<0.05)。在RASF模型中轉(zhuǎn)染慢病毒LV3-miR-21后，在IL-6刺激下，p-STAT3/STAT3較對(duì)照組表達(dá)下調(diào)，SOCS3上調(diào)，對(duì)照組在IL-

14、6刺激下，p-STAT3/STAT3高表達(dá)，而在轉(zhuǎn)染組則低表達(dá)。
　　5.結(jié)論:
　　1.Tocilizumab可大幅度降低炎癥指標(biāo)（CRP、ESR、FER），對(duì)ALT/AST、血脂代謝有影響，阻斷IL-6可調(diào)節(jié)亢進(jìn)的體液免疫及調(diào)節(jié)CD4+T、CD19+B細(xì)胞，減輕關(guān)節(jié)破壞。Tocilizumab可有效的控制DMARDs療效不佳的SJIA病情發(fā)展；
　　2.JIA中 miR-19a、miR-21表達(dá)水平的降低，提示與J