鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶在大鼠血管平滑肌細(xì)胞鈣化中的作用.pdf

1、目的:血管鈣化是由細(xì)胞和分子參與的、類似于骨形成的主動(dòng)過(guò)程。當(dāng)調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)分化的信號(hào)系統(tǒng)出現(xiàn)紊亂時(shí),VSMCs維持增殖表型或向成軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等間質(zhì)細(xì)胞系轉(zhuǎn)化,導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化、血管鈣化等血管性疾病,因此,VSMCs是聯(lián)系骨代謝和血管鈣化的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)之一。深入研究VSMCs鈣化的發(fā)病機(jī)制,預(yù)防、延緩或逆轉(zhuǎn)細(xì)胞鈣化的發(fā)生,具有重要的臨床意義。

2、>　　 鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(calcineurin,CaN)是絲/蘇氨酸蛋白磷酸酶家族成員,屬于PP2B家族,是唯一受Ca2+/鈣調(diào)素調(diào)節(jié)的磷蛋白磷酸酶。CaN組織分布廣泛,使底物NFATs去磷酸化而易位入核,激活下游基因轉(zhuǎn)錄,參與多種細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)。研究證實(shí)CaN在多個(gè)系統(tǒng)內(nèi)產(chǎn)生各種生物學(xué)效應(yīng)、分泌各種細(xì)胞因子。CaN不但參與成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞分化、成骨作用,而且還在VSMCs增殖及功能維持中起到重要作用,是否參與VSMCs鈣化的調(diào)節(jié)過(guò)

3、程,目前國(guó)內(nèi)外尚未見有報(bào)道。
　　 研究表明,高磷能以時(shí)間和劑量依賴性方式誘導(dǎo)VSMCs鈣化。本試驗(yàn)采用高磷培養(yǎng)基培養(yǎng)大鼠VSMCs,建立大鼠VSMCs鈣化模型,測(cè)定VSMCs中CaNB mRNA、蛋白質(zhì)的表達(dá)及CaN活性,VSMCs中Ca2+定量,堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)活性,并觀察CaN特異性抑制劑環(huán)孢霉素A(cyclosporinA,CsA)對(duì)CaN表達(dá)及對(duì)VSMCs鈣化的影響,初步探

4、討CaN對(duì)大鼠VSMCs鈣化的調(diào)節(jié)作用,為VSMCs鈣化的臨床防治提供新的思路。
　　 方法:大鼠VSMCs(A7r5)1株(購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)),經(jīng)傳代培養(yǎng)后,隨機(jī)分為3組,A組:對(duì)照組;B組:鈣化組:C組:鈣化+CsA組簡(jiǎn)稱CsA組。細(xì)胞培養(yǎng)至長(zhǎng)滿瓶底,測(cè)細(xì)胞密度為106/mm2,A組給予正常對(duì)照的培養(yǎng)基,B組給予磷酸二氫鈉配制的(2mmol/l)培養(yǎng)基,C組給予磷酸二氫鈉配制的2mmol/l的DMEM培養(yǎng)基同時(shí)加入5ug

5、/ml的CsA,分別培養(yǎng)6天,每3天換液一次,于第6天收集細(xì)胞。
　　 將收集的各組細(xì)胞Westem Blot測(cè)定CaNB蛋白、實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄PCR法測(cè)定CaNB mRNA、ELISA法測(cè)定VSMCs的Ca2+活性及CaN活性、比色法測(cè)定ALP活性、光鏡下觀察茜素紅染色大鼠VSMCs鈣化的情況。所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x-±s)表示,運(yùn)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件,對(duì)計(jì)量資料進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)及方差齊性檢驗(yàn),組間資料比較應(yīng)用單因

6、素方差分析,兩兩比較應(yīng)用LSD-t檢驗(yàn),P＜0.05即有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:(1)茜素紅染色結(jié)果示對(duì)照組大鼠VSMCs呈梭形,排列整齊,未見鈣化點(diǎn);鈣化組大鼠VSMCs呈梭形或多角形,排列紊亂,可見大量褐色鈣化點(diǎn);CsA組大鼠VSMCs呈梭形或多角形,排列紊亂,也可見大量褐色鈣化點(diǎn)。(2)ELISA法測(cè)定大鼠VSMCs CaN活性表達(dá)結(jié)果為鈣化組(21.47±1.86IU/L)較對(duì)照組(14.31±0.24IU/L)表達(dá)顯

7、著增加(P＜0.01),CsA組(15.34±0.14IU/L)較對(duì)照組(14.31±0.24IU/L)表達(dá)顯著增加(P＞0.05),無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,與CsA抑制CaN活性有關(guān),但較鈣化組(21.47±1.86IU/L)表達(dá)也顯著增加(P＜0.01),有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(3)ELISA法測(cè)定大鼠VSMCs Ca2+定量分析結(jié)果為鈣化組(9.01±0.32pg/ml)較對(duì)照組(6.03±0.33pg/ml)Ca2+定量顯著增加(P＜0.01),

8、CsA組(10.39±0.70pg/ml)較對(duì)照組(6.03±0.33pg/ml)Ca2+定量也顯著增加(P＜0.01),且較鈣化組(9.01±0.32pg/m1)Ca2+定量顯著增加(P＜0.05),有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(4)實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄PCR法測(cè)定CaNB mRNA表達(dá)結(jié)果為鈣化組CaNB mRNA表達(dá)(6.27±1.45)較對(duì)照組(1.10±0.28)顯著增加(P＜0.01);CsA組(3.38±0.77)較對(duì)照組(1.10±0.

9、28)表達(dá)顯著增加(P＜0.01),而較鈣化組(6.27±1.45)表達(dá)顯著減少(P＜0.01),有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(5)Western blot測(cè)定CaN B蛋白定量結(jié)果為鈣化組CaNB表達(dá)(69.11±2.51)較對(duì)照組(29.9±1.39)顯著增加(P＜0.01);CsA組(48.22±2.47)較對(duì)照組(29.9±1.39)表達(dá)顯著增加(P＜0.01),而較鈣化組(69.11±2.51)表達(dá)顯著減少(P＜0.01),有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(

10、6)用比色法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)ALP活性結(jié)果為鈣化組的ALP活性(146.04±9.02U·g-1protein)較對(duì)照組(38.74±2.23 U·g-1protein)顯著增高(P＜0.01);CsA組(216.69±14.00 U·g-1protein)較對(duì)照組(38.74±2.23 U·g-1 protein)也顯著增高(P＜0.01),且較鈣化組(146.04±9.02 U·g-1protein)顯著增高(P＜0.01)。