p8在非小細胞肺癌中的功能及轉(zhuǎn)錄調(diào)控.pdf

1、目的:轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子p8是細胞脅迫相關(guān)基因，在唾液腺、胃腸、肝臟、腎臟及肺部有低水平的組成型表達，壓力條件會促使其表達增高并參與調(diào)節(jié)細胞周期和細胞凋亡等過程。據(jù)報道，p8與各種腫瘤的發(fā)生發(fā)展和惡性轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，一方面，p8能夠促進胰腺癌、乳腺癌、甲狀腺癌和膠質(zhì)瘤等腫瘤性疾病的進程;另一方面，p8對于前列腺癌有一定抑制作用。目前，p8在肺癌中的研究較少并且該基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制也罕有報道。希望通過本研究，在人類非小細胞肺癌細胞中探究p8的功能

2、，以及p8基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制，為更進一步理解肺癌的發(fā)生發(fā)展，尋找分子治療靶點提供理論依據(jù)。
　　方法:本實驗分為兩部分進行，第一部分主要研究p8對非小細胞肺癌發(fā)生發(fā)展的影響，第二部分則主要研究p8基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制。第一部分實驗，首先通過熒光實時定量RT-PCR及免疫組化，對各種腫瘤細胞系及非小細胞肺癌組織中p8的表達水平進行檢測;接下來在高表達p8的腫瘤細胞系中利用shRNA下調(diào)p8的表達，并觀察細胞形態(tài)學(xué)變化，然后通過West

3、ern blot檢測相關(guān)蛋白分子表達水平的變化，利用免疫熒光和吖啶橙染色等對下調(diào)p8表達的細胞所出現(xiàn)的各種形態(tài)學(xué)變化進行了分析，同時也通過BrdU增殖實驗、細胞劃痕實驗、體外軟瓊脂克隆形成實驗、β-半乳糖苷酶染色和流式細胞儀細胞周期檢測等方法，對下調(diào)p8表達的細胞的生物學(xué)功能進行了研究。在第二部分實驗中，利用ChIP及BSP對p8基因上游非編碼序列的組蛋白乙酰化、甲基化及DNA甲基化修飾進行了檢測，并通過3C(chromatin con

4、formation capture)技術(shù)對該段染色質(zhì)的空間構(gòu)象進行了分析，最后利用Luciferase實驗，對3C實驗中發(fā)現(xiàn)的3個相互作用的片段的功能進行了分析。
　　結(jié)果:第一部分實驗，通過對HUVEC，A549，H1155，H441，H69，H209，BEAS-2B，Hep3B,HepG2,SK-BR-3,MCF-7,MDA-MB-231,HeLa,U937及CRL-2922細胞系的檢測，發(fā)現(xiàn)p8在不同細胞系中表達存在差異，其

5、中非小細胞肺癌細胞A549及肝癌細胞Hep3B中p8表達水平極高，下調(diào)p8的表達會造成細胞形態(tài)及功能等方面的改變。首先，細胞指狀突起增多，E-cadherin，β-cantenin表達水平上升并在細胞膜上富集，而vimentin則出現(xiàn)下降，細胞體外遷移率降低(p＜0.001)，提示細胞發(fā)生了MET;同時，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大量光鏡可見的囊泡結(jié)構(gòu)，透射電鏡可見囊泡具有吞噬內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體等細胞器的功能;細胞內(nèi)LC3B-Ⅱ增多并在囊泡周圍富集，囊泡能

6、夠被吖啶橙著色，表現(xiàn)為橙色熒光，而3-MA和氯喹能夠抑制囊泡的形成，說明囊泡可能來源與自噬小體與溶酶體的融合;下調(diào)p8表達后，腫瘤細胞體外增殖及克隆形成能力明顯下降(p＜0.001)，細胞被阻滯在G1期，表明細胞自噬后期發(fā)生阻斷。第二部分實驗，ChIP及BSP檢測結(jié)果顯示，活躍的p8基因啟動子區(qū)域富集組蛋白H3K9乙?；虷3K4雙甲基化修飾，而CpG位點低甲基化，但突變CpG位點并不能顯著影響p8基因的活性;p8基因上游約14kb的非

7、編碼序列中H3K4單甲基化和H3K27乙?；揎棾潭鹊?，同時3C實驗證實該非編碼區(qū)的環(huán)狀空間構(gòu)象拉近了位于其上的C1，C2及C3片段的距離，形成一個復(fù)合體，并通過與啟動子結(jié)合影響p8基因的轉(zhuǎn)錄;Luciferase實驗證實上述3個片段在空間上形成的復(fù)合體能夠幾乎完全抑制p8基因的啟動子的活性，具有下調(diào)子的功能。
　　結(jié)論:通過本研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)p8表達能夠顯著影響非小細胞肺癌細胞自噬的發(fā)生發(fā)展;同時也發(fā)現(xiàn)乙?；图谆缺碛^遺傳修飾