非小細(xì)胞肺癌中Egr-1對(duì)survivin的轉(zhuǎn)錄調(diào)控.pdf

1、目的：探討非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）中Egr-1對(duì)survivin啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的影響。
　　方法：（1）免疫組化SP法檢測(cè)93例NSCLC和40例良性肺疾病組織中Egr-1和Survivin的蛋白表達(dá)；（2）RT-PCR檢測(cè)A549細(xì)胞和人成纖維細(xì)胞中egr-1 mRNA及survivin mRNA的表達(dá)；（3）A549細(xì)胞分為二組：PMA處理組和PMA未處理組，提取全細(xì)胞蛋白，Western Blot檢測(cè)Egr-1和Survi

2、vin的蛋白表達(dá)；（4）PMA（10ng/ml）預(yù)處理A549細(xì)胞0h、12h、24h后，提取核蛋白通過(guò)EMSA檢測(cè)PMA誘導(dǎo)前后A549細(xì)胞核蛋白的表達(dá)情況，檢測(cè)經(jīng)DIG標(biāo)記的可能含有Egr-1位點(diǎn)的survivin啟動(dòng)子部分序列與核蛋白的結(jié)合情況。
　　結(jié)果：（1）NSCLC組織中Survivin的陽(yáng)性率為83.9％(78/93)，明顯高于良性肺疾病組織7.5%(3/40)(p<0.05)；Egr-1在NSCLC中的陽(yáng)性率為6

3、.5%(6/93)，低于良性肺疾病組織95%(2/40)(p<0.05)；在癌旁組織中可見(jiàn)Survivin蛋白呈陰性表達(dá)而Egr-1蛋白呈陽(yáng)性表達(dá)。Survivin與Egr-1蛋白在NSCLC組織中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(rs'=-0.778 P<0.05)。（2）1.5%瓊脂糖凝膠電泳顯示，A549細(xì)胞組加入survivin PCR產(chǎn)物的泳道出現(xiàn)一條較亮的條帶，明顯高于GAPDH（光密度比值1.82），加入egr-1 PCR產(chǎn)物的泳道出現(xiàn)一條

4、很淡的條帶，明顯低于GAPDH（光密度比值0.42）；成纖維細(xì)胞組加入egr-1 PCR產(chǎn)物的泳道出現(xiàn)一條明顯高于GAPDH的條帶而加入survivin PCR產(chǎn)物的泳道出現(xiàn)條很淡的條帶（光密度比值0.03）。說(shuō)明A549細(xì)胞中survivin mRNA表達(dá)明顯高于egr-1，成纖維細(xì)胞中survivin mRNA表達(dá)明顯低于egr-1（P<0.05）。（3）以β-Actin為內(nèi)參，PMA未處理組：Survivin蛋白（光密度比值1.3

5、2）的表達(dá)高于Egr-1蛋白表達(dá)（光密度比值0.64），PMA處理組Egr-1蛋白表達(dá)（光密度比值1.52）明顯升高，Survivin蛋白（光密度比值0.81）表達(dá)略有下降（P<0.05）。（4）不加PMA誘導(dǎo)的泳道出現(xiàn)較淡的一條條帶（光密度148），加入PMA誘導(dǎo)12h的泳道出現(xiàn)一條明顯的條帶（光密度210），而加入PMA誘導(dǎo)24h的泳道條帶基本消失（光密度95），說(shuō)明PMA處理A549細(xì)胞12h是能與DIG-survivn標(biāo)記探針結(jié)

6、合的核蛋白表達(dá)的最佳誘導(dǎo)時(shí)間；survivin啟動(dòng)子序列-192bp~-163bp與A549細(xì)胞核蛋白作用，自顯影后出現(xiàn) DNA-核蛋白結(jié)合條帶；100倍過(guò)量的未標(biāo)記探針、Egr-1和Sp1的一致序列（EGRcons、Sp1cons）均競(jìng)爭(zhēng)了標(biāo)記探針，無(wú)條帶出現(xiàn)，Egr-1和Sp1的突變序列（EGRmut、 Sp1mut）則無(wú)競(jìng)爭(zhēng)作用，條帶依然存在。加入Egr-1抗體后，條帶滯后，加入Sp1抗體條帶未滯后，說(shuō)明與survivin啟動(dòng)子-