DEK在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及功能研究.pdf

1、前言：
　　 DEK是一種原癌基因,定位在6p22.3染色體,在急性髓系白血病(AML)的一亞型中第一次被報(bào)道。研究發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤如視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、肝細(xì)胞癌、結(jié)腸癌、膀胱癌、宮頸癌、惡性膠質(zhì)瘤、黑色素瘤以及成年人急性白血病中,DEK蛋白均出現(xiàn)過(guò)表達(dá)。DEK能部分抑制細(xì)胞的分化和過(guò)早衰老,并與惡性細(xì)胞抗凋亡相關(guān)。這些研究提示DEK在腫瘤細(xì)胞中有多種功能,是一個(gè)重要癌基因。
　　 但是DEK在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)情況與臨床病

2、理因素的關(guān)系還不清楚,其對(duì)肺癌細(xì)胞的作用及其作用機(jī)制未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。我們檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌中DEK的表達(dá)情況,分析了DEK表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系,通過(guò)干擾肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549,SPC中DEK的基因表達(dá),探討了DEK對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖及凋亡影響。
　　 材料與方法：
　　 1、組織來(lái)源
　　 112例原發(fā)性非小細(xì)胞肺癌標(biāo)本及38例相應(yīng)正常肺組織標(biāo)本來(lái)自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科存檔蠟塊,患者術(shù)前均未接受放化療。

3、男性72例,女性40例,年齡36～76歲,平均年齡61歲。按2004年WHO肺腫瘤組織學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn):鱗癌48例,腺癌64例;高分化41例,中分化47例,低分化24例,有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移43例,無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移69例。依據(jù)國(guó)際抗癌聯(lián)盟(UICC)修訂的肺癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn):Ⅰ期55例,Ⅱ期33例,Ⅲ期24例。
　　 2、免疫組織化學(xué)染色
　　 免疫組化檢測(cè)試劑盒和濃縮型DAB試劑盒為福建邁新生物工程有限公司產(chǎn)品,DEK多克隆抗體為Pro

4、teinTechGroup中國(guó)分公司一武漢三鷹生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。操作步驟簡(jiǎn)略為:將石蠟組織塊切成4μm厚的切片,脫蠟,脫水,在檸檬酸鹽抗原修復(fù)液中修復(fù)后,按SP法操作步驟進(jìn)行,一抗用抗DEK的多克隆抗體(1:200)4℃孵育過(guò)夜,生物素標(biāo)記的二抗37℃孵育30分鐘,DAB顯色,蘇木素染色。為證明DEK蛋白抗體免疫組化檢測(cè)的特異性,實(shí)驗(yàn)中以鼠IgG代替一抗作為對(duì)照,結(jié)果陰性。同時(shí),選擇DEK蛋白陽(yáng)性染色的切片,以PBS代替一抗的染色結(jié)

5、果為陰性作為可信的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 3、免疫組化結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)
　　 結(jié)果判定:以棕褐色顆粒位于細(xì)胞核內(nèi)判定為DEK陽(yáng)性染色結(jié)果。并根據(jù)Beesley分級(jí)法,按陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的比例將染色結(jié)果分為4級(jí)。0級(jí):陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為0～5%;1級(jí):陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為6%～25%;2級(jí):陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為26%～50%;3級(jí):陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為50%以上。同時(shí),計(jì)算陽(yáng)性率的方法設(shè)定為:(1)陽(yáng)性率:指1級(jí)和1級(jí)以上的陽(yáng)性染色病例百分?jǐn)?shù);(2)強(qiáng)陽(yáng)性率:指2級(jí)和

6、2級(jí)以上的陽(yáng)性染色病例百分?jǐn)?shù)。
　　 4、細(xì)胞培養(yǎng)和siRNA干擾
　　 人肺腺癌A549細(xì)胞系用含有10%胎牛血清和100U/mL青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基,肺癌細(xì)胞系SPC用含有10%胎牛血清和100U/mL青鏈霉素的1640培養(yǎng)基培養(yǎng),均在37℃,5%CO2條件的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
　　 轉(zhuǎn)染前24小時(shí)將細(xì)胞按50%密度接種于6孔板,采用DharmaFECT1轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染48小時(shí)后使用PCR和Weste

7、rnblot檢測(cè)干擾效率。
　　 5、RT-PCR
　　 對(duì)于培養(yǎng)的細(xì)胞或者剪碎的組織利用Trizol試劑(Invitrogen,USA)裂解,然后按照說(shuō)明書的步驟,提取總的RNA。我們使用AMVVer3.0(Takara,Shiga,Japan)試劑盒。PCR產(chǎn)物通過(guò)2%的瓊脂糖凝膠電泳,采用(ImageJ)Bio-ImagingSystem進(jìn)行灰度值測(cè)定,以β-actin作為內(nèi)參。
　　 6、WesternB

8、lot法檢測(cè)蛋白表達(dá)
　　 收集細(xì)胞加入裂解液充分裂解,低溫高速離心(4℃,15000轉(zhuǎn)/min,15min),提取上清為總蛋白。上樣蛋白量為60μg。電泳(10%SDS-PAGE凝膠)、轉(zhuǎn)印(50V,90min)、5%正常小牛血清封閉,抗DEK(1:2000,proteinTech)和抗β-actin(1:500),4℃孵育過(guò)夜,分別與對(duì)應(yīng)的二抗(1:4000,santacruz,USA)室溫孵育2h,ECL顯色,結(jié)果經(jīng)自動(dòng)電

9、泳凝膠成像分析儀(ChemiImager5500,AlphaInnotech,USA)采集,進(jìn)行灰度值測(cè)定。
　　 7、MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖及集落形成實(shí)驗(yàn)
　　 將單個(gè)細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板中,每孔體積100μl含3.5×103個(gè)細(xì)胞,培養(yǎng)24hr,每孔加入MTT(3-[4,5-2-y1]-2,5-diphenyltetrazoliumbromide)溶液(5mg/ml,Sigma,USA)繼續(xù)培養(yǎng)4hr,吸去上清液

10、,加入150ulDMSO(Sigma,USA),振蕩10min,490nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔光吸收值,以不含細(xì)胞的等體積培養(yǎng)基作對(duì)照。繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。集落形成實(shí)驗(yàn)在干擾48小時(shí)后接種400個(gè)細(xì)胞于6cm培養(yǎng)皿中2周后用蘇木素染色.
　　 8、數(shù)據(jù)分析
　　 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,對(duì)DEK表達(dá)和臨床病理因素的關(guān)系用卡方檢驗(yàn);采用t檢驗(yàn)檢測(cè)RT-PCR和WesternBlot結(jié)果中的灰度值。以P＜0.0

11、5為差異有意義。
　　 結(jié)果：
　　 1、DEK在非小細(xì)胞肺癌中過(guò)表達(dá)
　　 我們采用免疫組化的方法檢測(cè)了DEK蛋白在112例非小細(xì)胞肺癌組織及38例癌旁正常肺組織中的表達(dá)情況。在正常的肺組織中DEK的表達(dá)為陰性,38例正常支氣管上皮DEK表達(dá)均為陰性。在112例非小細(xì)胞肺癌中,DEK的陽(yáng)性表達(dá)率為58.9%(66/112),肺鱗狀細(xì)胞癌DEK的陽(yáng)性表達(dá)率為47.9%(23/48),肺腺癌中DEK陽(yáng)性表達(dá)率為67

12、.2%(43/64),陽(yáng)性信號(hào)主要表達(dá)于腫瘤細(xì)胞細(xì)胞核中。與正常組織相比,DEK蛋白在肺癌組織中表達(dá)率明顯增高,而且染色強(qiáng)度明顯增強(qiáng),具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
　　 2、DEK在非小細(xì)胞肺癌中與臨床病理因素相關(guān)
　　 對(duì)非小細(xì)胞肺癌中DEK表達(dá)與臨床病理因素關(guān)系進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,我們發(fā)現(xiàn)DEK的陽(yáng)性表達(dá)與年齡、性別、腫瘤大小無(wú)顯著關(guān)系。DEK的表達(dá)與病理組織學(xué)分型有關(guān),腺癌中的表達(dá)陽(yáng)性率明顯高于鱗癌,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p

13、=0.040)。DEK的陽(yáng)性表達(dá)與肺癌的分化(p=0.001),淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(p=0.025),p-TNM分期(p=0.017)有著顯著關(guān)系。
　　 3、在兩種肺癌細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染DEK特異性siRNA抑制肺癌細(xì)胞的增殖
　　 我們檢測(cè)了7種非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中DEK蛋白的表達(dá)情況,為了進(jìn)一步研究DEK的功能,選出肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和SPC,然后我們采用DEK特異性的siRNA干擾其在上述兩種細(xì)胞中的表達(dá)。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后,與轉(zhuǎn)

14、染亂序siRNA的細(xì)胞相比,轉(zhuǎn)染特異性干擾的細(xì)胞DEK的表達(dá)明顯下降(其中A549干擾效率71%;SPC干擾效率66%)。MTT法測(cè)定結(jié)果顯示,DEK特異性siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞增殖能力明顯低于對(duì)照組(P＜0.05)(可以看到第二天開始轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組相比,增殖能力下降)。與MTT結(jié)果相似,干擾DEK后,A549和SPC細(xì)胞的集落數(shù)目明顯下降,對(duì)照組比實(shí)驗(yàn)組:A549:(127+-14vs77+-9),SPC(178+-19vs94+-13