人腫瘤壞死因子內(nèi)含子對(duì)其基因表達(dá)影響的初步研究.pdf

1、[目的]
　　 腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)是由激活的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的一種多功能細(xì)胞因子，其最顯著的特征是在體內(nèi)外能直接殺傷腫瘤細(xì)胞，是一種具有潛在應(yīng)用價(jià)值的抗腫瘤生物制劑。使用染色體組TNF-α全長(zhǎng)基因(含三個(gè)內(nèi)含子)和cDNA基因構(gòu)建真核表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞，觀察外源TNF-α表達(dá)對(duì)細(xì)胞內(nèi)自身TNF-α基因表達(dá)的影響；初步探討TNF-α內(nèi)含子對(duì)染色體組TNF-α基因表達(dá)的影響

2、。
　　 [方法]
　　 從人Hella細(xì)胞中提取總RNA，RT-PCR擴(kuò)增出TNF-α的cDNA基因序列并構(gòu)建至真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)質(zhì)粒中，重組載體命名為TF。從人Hella細(xì)胞中提取染色體組總DNA，用PCR方法擴(kuò)增出全長(zhǎng)TNF-α基因序列并構(gòu)建至真核表達(dá)載pcDNA3.1(+)質(zhì)粒中，挑取正向、反向質(zhì)粒各一個(gè)(把neo基因與TNF-α cDNA的轉(zhuǎn)錄方向一致時(shí)的質(zhì)粒，稱為正向質(zhì)粒；方向相反，則稱為反向

3、質(zhì)粒)，測(cè)序證實(shí)后，重組正向質(zhì)粒載體命名TIA，重組反向質(zhì)粒載體命名為TIB。TF、TIA、TIB經(jīng)脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染CNE-2Z細(xì)胞、A549細(xì)胞、Hella細(xì)胞和K562細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48h后提取細(xì)胞總RNA分別進(jìn)行RT-PCR分析檢測(cè)內(nèi)源性和外源性基因的表達(dá)情況。用體外診斷試劑盒檢測(cè)腫瘤壞死因子的蛋白表達(dá)量。
　　 [結(jié)果]
　　 TF和TIA質(zhì)粒經(jīng)脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染在CNE-2Z細(xì)胞，A549細(xì)胞，Hella細(xì)胞和K562細(xì)

4、胞中成功；TF和TIA質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，TIB質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)不表達(dá)；TIA質(zhì)粒在轉(zhuǎn)染CNE-2Z細(xì)胞、A549細(xì)胞、Hella細(xì)胞和K562細(xì)胞中產(chǎn)生的TNF-α的表達(dá)量比TF質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞產(chǎn)生的表達(dá)量低。
　　 [結(jié)論]
　　 導(dǎo)入外源TNF-α全長(zhǎng)基因序列和TNF-αcDNA序列均能使細(xì)胞內(nèi)TNF-αmRNA表達(dá)的量和腫瘤壞死因子蛋白的表達(dá)量增加；而導(dǎo)入外源TNF-α全長(zhǎng)基因序列比導(dǎo)入TNF-α cDNA序列使細(xì)胞內(nèi)TN