過繼單一pMHC特異性的同種CTL清除體內(nèi)特定性狀的靶細(xì)胞.pdf

1、由于移植排斥反應(yīng)的存在，T細(xì)胞對(duì)于同種細(xì)胞的應(yīng)答通常被認(rèn)為是有害的。然而伴隨移植物抗宿主?。℅VHD）發(fā)生的移植物抗白血病反應(yīng)/移植物抗腫瘤反應(yīng)，表明了同種反應(yīng)性T細(xì)胞中存在一群有利的細(xì)胞，在清除惡性腫瘤中具有巨大作用。我們的前期工作提示同種T細(xì)胞與一般抗原反應(yīng)性T細(xì)胞一樣，識(shí)別的表位均為抗原肽/MHC復(fù)合物（pMHC），且均具有pMHC特異性，故在實(shí)際應(yīng)用中有可能根據(jù)同種反應(yīng)性T細(xì)胞的不同特異性將有利和不利的同種T細(xì)胞區(qū)分開。本研究擬

2、在單個(gè)pMHC水平上，提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)證實(shí)過繼單一表位特異性的同種CTL可在體內(nèi)清除特定性狀的靶細(xì)胞，同時(shí)避免多組織損傷的發(fā)生。不僅有利于進(jìn)一步認(rèn)識(shí)同種反應(yīng)發(fā)生的機(jī)制及其規(guī)律，而且為利用同種T細(xì)胞打破病理性耐受（慢性感染與腫瘤等）提供了新手段。
　　 然而由于細(xì)胞表面存在極其繁多的pMHC，用傳統(tǒng)的方法制備獲得的同種反應(yīng)性T細(xì)胞為針對(duì)多種表位的細(xì)胞群體。因此，本研究通過建立“單一表位特異性同種T細(xì)胞誘導(dǎo)體系”制備單一表位特異性同種C

3、TL（胰島素肽/H-2Kb特異性同種CTL），并過繼輸入動(dòng)物體內(nèi)，攻擊表達(dá)該pMHC的靶細(xì)胞（H-2b小鼠的胰島b細(xì)胞），觀察其特異性殺傷效應(yīng)。論文共分為三部分，其主要內(nèi)容與結(jié)果如下：
　　 一、制備H-2Kb/IgG2aFc分子，其能有效結(jié)合到C3H小鼠巨噬細(xì)胞表面
　　 首先通過融合C57BL/6小鼠H-2Kb重鏈胞外段和IgG2aFc段獲得H-2Kb/IgG2aFc融合基因，并與小鼠小鼠β2m基因分別插入桿狀病毒雙

4、表達(dá)載體pFastBacTMDual的PP10和PPH啟動(dòng)子下游，利用昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)以二聚體形式存在的β2m/H-2Kb/IgG2aFc分子（簡稱H-2Kb二聚體）。融合分子中IgG2aFc為高親和力的Fc，可通過與FcR的相互作用加載H-2Kb二聚體到C3H小鼠巨噬細(xì)胞（H-2Kk）表面，使其能夠 “提呈”單一同種表位（特異性肽/H-2Kb），從而為誘導(dǎo)單一pMHC特異性的同種CTL奠定了基礎(chǔ)。
　　 二、體內(nèi)外聯(lián)合

5、誘導(dǎo)自身/同系淋巴細(xì)胞產(chǎn)生胰島素肽/H-2Kb特異性的同種CTL
　　 利用加載了胰島素肽/H-2Kb二聚體的自身巨噬細(xì)胞作為抗原刺激細(xì)胞，經(jīng)過腹腔注射C3H小鼠（H-2Kk），誘導(dǎo)其產(chǎn)生針對(duì)胰島素肽/H-2Kb表位的特異性同種T細(xì)胞，收集并對(duì)其進(jìn)行特異性四聚體染色和細(xì)胞毒效應(yīng)檢測。結(jié)果顯示誘導(dǎo)產(chǎn)生的CD8+T細(xì)胞特異性四聚體染色頻率顯著高于非特異性四聚體染色頻率；同時(shí)，該CTL對(duì)具有相應(yīng)表位（胰島素肽/H-2Kb）的靶細(xì)胞具

6、有明顯的殺傷作用，而對(duì)無關(guān)表位的靶細(xì)胞殺傷率極低。
　　 三、尾靜脈過繼誘生的單一pMHC特異性的同種T細(xì)胞定向損傷胰島β細(xì)胞
　　 將胰島素肽/H-2Kb特異性CTL由尾靜脈分別過繼受者C57BL/6小鼠(H-2b)、B6C3F1小鼠（H-2b×k）和SCID beige小鼠（H-2d），過繼后監(jiān)測血糖、胰島素及淋巴細(xì)胞浸潤情況。結(jié)果顯示接受過繼后，受者C57BL/6和B6C3F1小鼠第3天便出現(xiàn)明顯的血糖升高，胰島素