EB病毒潛伏膜蛋白2A蛋白負載樹突狀細胞激發(fā)特異性CTL的研究.pdf

1、EB病毒(Epstein-Barr Vires，EBV)屬于皰疹病毒Y亞科嗜淋巴細胞病毒成員，在世界各地廣泛分布，為95％以上的成人所攜帶，是較早認識的與人類腫瘤相關的病毒。自1966年Old在鼻咽癌(nasopharyngeall carcinoma，NPC)組織中首先發(fā)現(xiàn)存在有EB病毒DNA以來，大量的血清流行病學研究已證明EB病毒與鼻咽癌有關。鼻咽癌是上皮來源的惡性腫瘤，高發(fā)于東南亞及我國華南地區(qū)。臨床上鼻咽癌通常不宜手術(shù)治療，放

2、療、化療后也不能完全有效清除腫瘤細胞，部分患者易復發(fā)和轉(zhuǎn)移，并且治療產(chǎn)生的副作用又影響了自身的免疫系統(tǒng)。因此目前，在倡導鼻咽癌綜合治療的同時更加注重免疫治療。 以CTL為基礎的免疫治療需選擇合適的靶抗原。鼻咽癌腫瘤細胞中EB病毒蛋白呈潛伏Ⅱ型表達，即僅表達低免疫原性抗原EBNA1、LMP1、LMP2。EBNA1在誘導特異性T細胞的同時，也能誘導CD4<'+>調(diào)節(jié)性Treg細胞，抑制機體的免疫應答，且EBNA1記憶性CTL反應主要

3、受HLAB3501，B7等限制。LMP1已被確認為能夠使正常細胞發(fā)生轉(zhuǎn)化癌基因蛋白，CTL識別的靶位易突變，免疫原性也弱于LMP2。目前認為，LMP2A是免疫治療理想的靶抗原，序列相對保守，具有潛在性的T胞表位。在NPC病人血液中能檢出針對EB病毒LMP2的CTL前體細胞，但其數(shù)目及反應性明顯低于健康攜帶者，導致機體對腫瘤的免疫耐受。所以糾正這種CTL的低應答狀態(tài)對于機體有效清除腫瘤細胞至關重要，誘導EBV特異性CTL是鼻咽癌免疫治療的

4、關鍵。 T胞只能識別由抗原遞呈細胞(APC)遞呈的抗原肽-MHC分子復合物。樹突狀細胞(DC)是目前發(fā)現(xiàn)功能最強的APC，能激發(fā)初始型和記憶型T細胞，產(chǎn)生有效的CTL應答。以DC為基礎的免疫治療已在許多腫瘤的治療中取得了良好的效果，是當前抗腫瘤免疫治療研究的熱點之一。 本課題用DC作為鼻咽癌免疫治療的APC，選用EB病毒LMP2A作為免疫治療的靶抗原，以分子生物學和細胞生物學方法構(gòu)建LMP2A穩(wěn)定表達細胞株，純化LMP2A蛋白，

5、并對EBV相關的NPC病人的血清進行了檢測；蛋白負載經(jīng)體外擴增的EB病毒陽性健康攜帶者的DC；負載的DC分別與自體外周血CD4<'+>和CD8<'+>T混合培養(yǎng)，激發(fā)出LMP2A特異性CD4<'+>和CD8<'+>T，并對其功能進行研究。主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下： 一、EB病毒LMP2A基因重組逆轉(zhuǎn)錄病毒和穩(wěn)定表達LMP2A細胞株的構(gòu)建 用PCR從質(zhì)粒pPICZ-α/LMP2A擴增EBV的LMP2A基因片斷，經(jīng)EcoR Ⅰ

6、、BamH Ⅰ酶切后定向插入含同樣酶切位點的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體psIV-1的LTR啟動子下游，構(gòu)建重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pSIV-1/LMP2A，重組質(zhì)粒經(jīng)PCR、EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ雙酶切及序列分析鑒定。獲得的重組質(zhì)粒與兩個輔助病毒載體pHIT456和pHIT60用脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染包裝細胞293T，轉(zhuǎn)化后的細胞用G418篩選，經(jīng)1周篩選培養(yǎng)后獲得抗性細胞克隆，將抗性細胞擴大培養(yǎng)，收集含有重組逆轉(zhuǎn)錄病毒顆?？剐约毎寺∨囵B(yǎng)上清。PCR結(jié)果

7、顯示在抗性細胞克隆基因組中存在LMP2A基因。用重組逆轉(zhuǎn)錄病毒感染NIH3T3細胞，計算病毒滴度，并于感染后48小時用PCR、間接免疫熒光、Western blot檢測目的基因的整合和表達。結(jié)果顯示，擴增到的病毒效價為5×10<'5>CFU/ml，PCR陽性結(jié)果提示LMP2A能整合于MIH3T3細胞中，間接免疫熒光顯示NIH3T3細胞有LMP2A的表達，Western blot顯示在54KDa處出現(xiàn)特異的蛋白條帶。表明重組逆轉(zhuǎn)錄病毒能有

8、效地介導LMP2A基因在真核細胞中表達。用重組逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒重復3次感染L929細胞，72小時后置于含G418選擇性培養(yǎng)基中，篩選培養(yǎng)2周后，獲得抗性細胞克隆。PCR陽性結(jié)果提示LMP2A能整合于L929細胞中，RT-PCR結(jié)果表明LMP2A基因能轉(zhuǎn)錄成相應的mRNA。流式細胞儀顯示91.3％的細胞能表達LMP2A，Western blot出現(xiàn)特異的蛋白條帶。提取細胞蛋白，經(jīng)His Bind Ni-NTA親和層析柱純化，得到純度達90％

9、以上的LMP2A蛋白。 采用純化的LMP2A蛋白作為抗原，用ELISA法檢測EB病毒相關鼻咽癌患者血清中的抗體，結(jié)果顯示鼻咽癌患者血清中存在著高滴度的抗LMP2A的抗體，檢出率為72.29％。比較NPC病人LMP2A血清學檢測結(jié)果與臨床上VCA、EA法結(jié)果，三者檢出率相當，大部分病例呈正相關，但一些病例中VCA、EA檢出率低的LMP2A檢出率高，而一些病例VCA、EA檢出率高的LMP2A檢出率低。因此，如將三者結(jié)合有助于提高鼻咽

10、癌患者的檢出率，LMP2A對鼻咽癌的檢測具有輔助診斷意義。 二、人外周血樹突狀細胞的培養(yǎng)鑒定及EB病毒LMP2A蛋白的負載 分離EBV陽性的健康人外周血單核細胞，在含重組hGM-CSF和hIL-4的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，用hTNF-α誘導DC成熟。共聚焦顯微鏡觀察其形態(tài)，流式細胞儀檢測細胞的表面分子。結(jié)果顯示，從健康人外周血分離得到的單核細胞，體外經(jīng)重組hGM-CSF、hIL-4的培養(yǎng)可獲得未成熟的DC，流式細胞儀檢測DC相對特

11、異性標記CD1a、CD83及共刺激分子CD80、HLA-DR等表達較低，而單核細胞特異性標志CD14相對較高；當加入hTNF-α繼續(xù)培養(yǎng)2天后，得到大量成熟DC，DC特異性標記CD1a、CD83及共刺激分子CD80、HLA-DR表達顯著升高，CD14表達下調(diào)。光學顯微鏡下觀察誘導成熟的DC具有典型樹突狀特征。用不同濃度的LMP2A蛋白負載未成熟的DC，誘導成熟后激光共聚焦檢測DC俘獲抗原的能力，F(xiàn)ACS選擇最佳蛋白負載濃度；用最佳L,M

12、P2A蛋白濃度負載未成熟的DC，F(xiàn)ACS檢測負載前后誘導成熟DC表面分子CD1a、CD83、CD14、CD80、HLA-DR變化及LMZP2A表達情況；并用<'3>H-TdR摻入法檢測負載前后誘導成熟DC刺激同種淋巴細胞增殖能力。結(jié)果顯示， 40μg/ml為LMP2A蛋白轉(zhuǎn)染DC的最佳濃度，共聚焦和FACS結(jié)果顯示約80％的DC表達LMP2A蛋白；LMP2A負載后誘導的成熟DC對細胞表面共刺激分子及特征性表面標志無影響；負載后誘導成熟D

13、C仍具有較強的刺激同種淋巴細胞增殖能力。研究結(jié)果為蛋白負載DC免疫治療NPC提供可能。 三、EB病毒LP2A蛋白負載樹突狀細胞激發(fā)特異性CTL及體外殺傷活性的研究 免疫微磁珠分離獲得自體CD4<'+>和CD8<'+>T細胞，F(xiàn)ACS鑒定分選細胞純度均大于95％。<'3>H-TdR摻入法細胞增殖實驗檢測CD4<'+>和CD8<'+>T細胞經(jīng)LMP2A蛋白負載自體DC或未負載DC刺激后的增殖水平。ELISA法檢測CD4<'+

14、>T細胞經(jīng)抗原負載后的DC刺激分泌IFN-γ和IL-10的水平。<'3>H-TdR摻入法結(jié)果顯示，CD4<'+>和CD8<'+>T細胞經(jīng)LMP2A蛋白負載自體DC刺激后的增殖水平明顯高于未負載組(P<0.001，P<0.001)，表明DC能夠俘獲抗原并將抗原提呈給自體的T淋巴細胞，同時LMP2A蛋白含有MHC-Ⅰ和Ⅱ類分子限制性的靶位。ELISA法檢測結(jié)果顯示，CD4<'+>T細胞經(jīng)負載后的DC刺激分泌IFN-γ明顯高于未負載DC組(P

15、=0.034)，而IL-10在各組中的分泌水平均很低。構(gòu)建含有綠色熒光蛋白報告基因(GFP)熒光標記的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pPGEZ-Term/LMP2A，與輔助病毒載體PHT 456和PHI 60共轉(zhuǎn)染包裝細胞293T，收集含有Zeocine的抗性細胞培養(yǎng)上清。用此重組逆轉(zhuǎn)錄病毒感染第1天誘導的未成熟DC，感染后繼續(xù)在含hGM-CSF、hIL-4的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，重復感染3次，用hTNF-α誘導DC成熟。熒光顯微鏡觀察重組逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染2

16、93T細胞情況及FACS檢測LMP2A在DC上的表達，并以此作為靶細胞。結(jié)果顯示，熒光顯微鏡下觀察293細胞可見綠色熒光，F(xiàn)ACS檢測出56.4％的DC能表達LMP2A。 采用重復刺激技術(shù)獲得LMP2A特異性CD8<'+>T細胞，分別以轉(zhuǎn)染重組逆轉(zhuǎn)錄病毒pPGEZ-Term/LMP2A或空載體的自體成熟DC,LCL、K562細胞作為靶細胞，用LDH釋放法檢測CTL的殺傷活性。FACS檢測CTL殺傷靶細胞(重組逆轉(zhuǎn)錄病毒pPGEZ

17、-Term/LMP2A轉(zhuǎn)染的自體成熟DC)后CD4<'+>和CD8<'+>T細胞胞內(nèi)分泌細胞因子IFN-γ水平。LDH檢測結(jié)果顯示，LMP2A蛋白負載DC可以誘導出針對EBV-LMP2A特異的CTL，能夠特異性的殺傷重組逆轉(zhuǎn)錄病毒pPGEZ-Term/LMP2A轉(zhuǎn)染自體的成熟DC(P=0.023)。FACS結(jié)果顯示，經(jīng)LMP2A負載的DC誘導的特異性CD4<'+>和CD8<'+>T與靶細胞孵育后，胞內(nèi)分泌細胞因子IFN-γ水平明顯高于對