EB病毒潛伏膜蛋白2A蛋白負(fù)載樹突狀細(xì)胞激發(fā)特異性CTL的研究.pdf

1、EB病毒(Epstein-Barr Vires，EBV)屬于皰疹病毒Y亞科嗜淋巴細(xì)胞病毒成員，在世界各地廣泛分布，為95％以上的成人所攜帶，是較早認(rèn)識(shí)的與人類腫瘤相關(guān)的病毒。自1966年Old在鼻咽癌(nasopharyngeall carcinoma，NPC)組織中首先發(fā)現(xiàn)存在有EB病毒DNA以來(lái)，大量的血清流行病學(xué)研究已證明EB病毒與鼻咽癌有關(guān)。鼻咽癌是上皮來(lái)源的惡性腫瘤，高發(fā)于東南亞及我國(guó)華南地區(qū)。臨床上鼻咽癌通常不宜手術(shù)治療，放

2、療、化療后也不能完全有效清除腫瘤細(xì)胞，部分患者易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，并且治療產(chǎn)生的副作用又影響了自身的免疫系統(tǒng)。因此目前，在倡導(dǎo)鼻咽癌綜合治療的同時(shí)更加注重免疫治療。 以CTL為基礎(chǔ)的免疫治療需選擇合適的靶抗原。鼻咽癌腫瘤細(xì)胞中EB病毒蛋白呈潛伏Ⅱ型表達(dá)，即僅表達(dá)低免疫原性抗原EBNA1、LMP1、LMP2。EBNA1在誘導(dǎo)特異性T細(xì)胞的同時(shí)，也能誘導(dǎo)CD4<'+>調(diào)節(jié)性Treg細(xì)胞，抑制機(jī)體的免疫應(yīng)答，且EBNA1記憶性CTL反應(yīng)主要

3、受HLAB3501，B7等限制。LMP1已被確認(rèn)為能夠使正常細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化癌基因蛋白，CTL識(shí)別的靶位易突變，免疫原性也弱于LMP2。目前認(rèn)為，LMP2A是免疫治療理想的靶抗原，序列相對(duì)保守，具有潛在性的T胞表位。在NPC病人血液中能檢出針對(duì)EB病毒LMP2的CTL前體細(xì)胞，但其數(shù)目及反應(yīng)性明顯低于健康攜帶者，導(dǎo)致機(jī)體對(duì)腫瘤的免疫耐受。所以糾正這種CTL的低應(yīng)答狀態(tài)對(duì)于機(jī)體有效清除腫瘤細(xì)胞至關(guān)重要，誘導(dǎo)EBV特異性CTL是鼻咽癌免疫治療的

4、關(guān)鍵。 T胞只能識(shí)別由抗原遞呈細(xì)胞(APC)遞呈的抗原肽-MHC分子復(fù)合物。樹突狀細(xì)胞(DC)是目前發(fā)現(xiàn)功能最強(qiáng)的APC，能激發(fā)初始型和記憶型T細(xì)胞，產(chǎn)生有效的CTL應(yīng)答。以DC為基礎(chǔ)的免疫治療已在許多腫瘤的治療中取得了良好的效果，是當(dāng)前抗腫瘤免疫治療研究的熱點(diǎn)之一。 本課題用DC作為鼻咽癌免疫治療的APC，選用EB病毒LMP2A作為免疫治療的靶抗原，以分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)方法構(gòu)建LMP2A穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，純化LMP2A蛋白，

5、并對(duì)EBV相關(guān)的NPC病人的血清進(jìn)行了檢測(cè)；蛋白負(fù)載經(jīng)體外擴(kuò)增的EB病毒陽(yáng)性健康攜帶者的DC；負(fù)載的DC分別與自體外周血CD4<'+>和CD8<'+>T混合培養(yǎng)，激發(fā)出LMP2A特異性CD4<'+>和CD8<'+>T，并對(duì)其功能進(jìn)行研究。主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下： 一、EB病毒LMP2A基因重組逆轉(zhuǎn)錄病毒和穩(wěn)定表達(dá)LMP2A細(xì)胞株的構(gòu)建 用PCR從質(zhì)粒pPICZ-α/LMP2A擴(kuò)增EBV的LMP2A基因片斷，經(jīng)EcoR Ⅰ

6、、BamH Ⅰ酶切后定向插入含同樣酶切位點(diǎn)的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體psIV-1的LTR啟動(dòng)子下游，構(gòu)建重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pSIV-1/LMP2A，重組質(zhì)粒經(jīng)PCR、EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ雙酶切及序列分析鑒定。獲得的重組質(zhì)粒與兩個(gè)輔助病毒載體pHIT456和pHIT60用脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞293T，轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞用G418篩選，經(jīng)1周篩選培養(yǎng)后獲得抗性細(xì)胞克隆，將抗性細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，收集含有重組逆轉(zhuǎn)錄病毒顆?？剐约?xì)胞克隆培養(yǎng)上清。PCR結(jié)果

7、顯示在抗性細(xì)胞克隆基因組中存在LMP2A基因。用重組逆轉(zhuǎn)錄病毒感染NIH3T3細(xì)胞，計(jì)算病毒滴度，并于感染后48小時(shí)用PCR、間接免疫熒光、Western blot檢測(cè)目的基因的整合和表達(dá)。結(jié)果顯示，擴(kuò)增到的病毒效價(jià)為5×10<'5>CFU/ml，PCR陽(yáng)性結(jié)果提示LMP2A能整合于MIH3T3細(xì)胞中，間接免疫熒光顯示NIH3T3細(xì)胞有LMP2A的表達(dá)，Western blot顯示在54KDa處出現(xiàn)特異的蛋白條帶。表明重組逆轉(zhuǎn)錄病毒能有

8、效地介導(dǎo)LMP2A基因在真核細(xì)胞中表達(dá)。用重組逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒重復(fù)3次感染L929細(xì)胞，72小時(shí)后置于含G418選擇性培養(yǎng)基中，篩選培養(yǎng)2周后，獲得抗性細(xì)胞克隆。PCR陽(yáng)性結(jié)果提示LMP2A能整合于L929細(xì)胞中，RT-PCR結(jié)果表明LMP2A基因能轉(zhuǎn)錄成相應(yīng)的mRNA。流式細(xì)胞儀顯示91.3％的細(xì)胞能表達(dá)LMP2A，Western blot出現(xiàn)特異的蛋白條帶。提取細(xì)胞蛋白，經(jīng)His Bind Ni-NTA親和層析柱純化，得到純度達(dá)90％

9、以上的LMP2A蛋白。 采用純化的LMP2A蛋白作為抗原，用ELISA法檢測(cè)EB病毒相關(guān)鼻咽癌患者血清中的抗體，結(jié)果顯示鼻咽癌患者血清中存在著高滴度的抗LMP2A的抗體，檢出率為72.29％。比較NPC病人LMP2A血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果與臨床上VCA、EA法結(jié)果，三者檢出率相當(dāng)，大部分病例呈正相關(guān)，但一些病例中VCA、EA檢出率低的LMP2A檢出率高，而一些病例VCA、EA檢出率高的LMP2A檢出率低。因此，如將三者結(jié)合有助于提高鼻咽

10、癌患者的檢出率，LMP2A對(duì)鼻咽癌的檢測(cè)具有輔助診斷意義。 二、人外周血樹突狀細(xì)胞的培養(yǎng)鑒定及EB病毒LMP2A蛋白的負(fù)載 分離EBV陽(yáng)性的健康人外周血單核細(xì)胞，在含重組hGM-CSF和hIL-4的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，用hTNF-α誘導(dǎo)DC成熟。共聚焦顯微鏡觀察其形態(tài)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的表面分子。結(jié)果顯示，從健康人外周血分離得到的單核細(xì)胞，體外經(jīng)重組hGM-CSF、hIL-4的培養(yǎng)可獲得未成熟的DC，流式細(xì)胞儀檢測(cè)DC相對(duì)特

11、異性標(biāo)記CD1a、CD83及共刺激分子CD80、HLA-DR等表達(dá)較低，而單核細(xì)胞特異性標(biāo)志CD14相對(duì)較高；當(dāng)加入hTNF-α繼續(xù)培養(yǎng)2天后，得到大量成熟DC，DC特異性標(biāo)記CD1a、CD83及共刺激分子CD80、HLA-DR表達(dá)顯著升高，CD14表達(dá)下調(diào)。光學(xué)顯微鏡下觀察誘導(dǎo)成熟的DC具有典型樹突狀特征。用不同濃度的LMP2A蛋白負(fù)載未成熟的DC，誘導(dǎo)成熟后激光共聚焦檢測(cè)DC俘獲抗原的能力，F(xiàn)ACS選擇最佳蛋白負(fù)載濃度；用最佳L,M

12、P2A蛋白濃度負(fù)載未成熟的DC，F(xiàn)ACS檢測(cè)負(fù)載前后誘導(dǎo)成熟DC表面分子CD1a、CD83、CD14、CD80、HLA-DR變化及LMZP2A表達(dá)情況；并用<'3>H-TdR摻入法檢測(cè)負(fù)載前后誘導(dǎo)成熟DC刺激同種淋巴細(xì)胞增殖能力。結(jié)果顯示， 40μg/ml為L(zhǎng)MP2A蛋白轉(zhuǎn)染DC的最佳濃度，共聚焦和FACS結(jié)果顯示約80％的DC表達(dá)LMP2A蛋白；LMP2A負(fù)載后誘導(dǎo)的成熟DC對(duì)細(xì)胞表面共刺激分子及特征性表面標(biāo)志無(wú)影響；負(fù)載后誘導(dǎo)成熟D

13、C仍具有較強(qiáng)的刺激同種淋巴細(xì)胞增殖能力。研究結(jié)果為蛋白負(fù)載DC免疫治療NPC提供可能。 三、EB病毒LP2A蛋白負(fù)載樹突狀細(xì)胞激發(fā)特異性CTL及體外殺傷活性的研究 免疫微磁珠分離獲得自體CD4<'+>和CD8<'+>T細(xì)胞，F(xiàn)ACS鑒定分選細(xì)胞純度均大于95％。<'3>H-TdR摻入法細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CD4<'+>和CD8<'+>T細(xì)胞經(jīng)LMP2A蛋白負(fù)載自體DC或未負(fù)載DC刺激后的增殖水平。ELISA法檢測(cè)CD4<'+

14、>T細(xì)胞經(jīng)抗原負(fù)載后的DC刺激分泌IFN-γ和IL-10的水平。<'3>H-TdR摻入法結(jié)果顯示，CD4<'+>和CD8<'+>T細(xì)胞經(jīng)LMP2A蛋白負(fù)載自體DC刺激后的增殖水平明顯高于未負(fù)載組(P<0.001，P<0.001)，表明DC能夠俘獲抗原并將抗原提呈給自體的T淋巴細(xì)胞，同時(shí)LMP2A蛋白含有MHC-Ⅰ和Ⅱ類分子限制性的靶位。ELISA法檢測(cè)結(jié)果顯示，CD4<'+>T細(xì)胞經(jīng)負(fù)載后的DC刺激分泌IFN-γ明顯高于未負(fù)載DC組(P

15、=0.034)，而IL-10在各組中的分泌水平均很低。構(gòu)建含有綠色熒光蛋白報(bào)告基因(GFP)熒光標(biāo)記的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pPGEZ-Term/LMP2A，與輔助病毒載體PHT 456和PHI 60共轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞293T，收集含有Zeocine的抗性細(xì)胞培養(yǎng)上清。用此重組逆轉(zhuǎn)錄病毒感染第1天誘導(dǎo)的未成熟DC，感染后繼續(xù)在含hGM-CSF、hIL-4的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，重復(fù)感染3次，用hTNF-α誘導(dǎo)DC成熟。熒光顯微鏡觀察重組逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染2

16、93T細(xì)胞情況及FACS檢測(cè)LMP2A在DC上的表達(dá)，并以此作為靶細(xì)胞。結(jié)果顯示，熒光顯微鏡下觀察293細(xì)胞可見綠色熒光，F(xiàn)ACS檢測(cè)出56.4％的DC能表達(dá)LMP2A。 采用重復(fù)刺激技術(shù)獲得LMP2A特異性CD8<'+>T細(xì)胞，分別以轉(zhuǎn)染重組逆轉(zhuǎn)錄病毒pPGEZ-Term/LMP2A或空載體的自體成熟DC,LCL、K562細(xì)胞作為靶細(xì)胞，用LDH釋放法檢測(cè)CTL的殺傷活性。FACS檢測(cè)CTL殺傷靶細(xì)胞(重組逆轉(zhuǎn)錄病毒pPGEZ

17、-Term/LMP2A轉(zhuǎn)染的自體成熟DC)后CD4<'+>和CD8<'+>T細(xì)胞胞內(nèi)分泌細(xì)胞因子IFN-γ水平。LDH檢測(cè)結(jié)果顯示，LMP2A蛋白負(fù)載DC可以誘導(dǎo)出針對(duì)EBV-LMP2A特異的CTL，能夠特異性的殺傷重組逆轉(zhuǎn)錄病毒pPGEZ-Term/LMP2A轉(zhuǎn)染自體的成熟DC(P=0.023)。FACS結(jié)果顯示，經(jīng)LMP2A負(fù)載的DC誘導(dǎo)的特異性CD4<'+>和CD8<'+>T與靶細(xì)胞孵育后，胞內(nèi)分泌細(xì)胞因子IFN-γ水平明顯高于對(duì)