HBV感染者中抗原特異性CTL免疫應(yīng)答狀況的研究.pdf

1、目的：
　　 1.建立體外分析抗原特異性T細(xì)胞的檢測方法--四聚體染色技術(shù)，為深入探討表位特異性CTL的生物學(xué)功能以及更全面理解HBV特異CTL 在HBV感染中的致病機(jī)理奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)；
　　 2. 應(yīng)用四聚體染色技術(shù)和流式染色分析抗原特異性CTL在自限性和慢性HBV感染中頻率和生物學(xué)功能；
　　 3. 分析HBV 慢性感染者抗原特異性CTL細(xì)胞功能耗竭可能機(jī)制，為慢性感染免疫調(diào)節(jié)治療提供可能途徑和新的治療靶點(diǎn)。<

2、br>　　 方法：
　　 1. 應(yīng)用基因工程技術(shù)原核高效表達(dá)HLA-A*0201-BSP、HLA-A*2402-BSP、HLA-A*1101-BSP和β2m 蛋白后，分別與常見的HBV 抗原肽在體外復(fù)性折疊成可溶性的抗原肽復(fù)合物單體；經(jīng)BirA酶作用并通過凝膠過濾層析法純化復(fù)合物單體；分別將復(fù)合物單體與藻紅蛋白標(biāo)記的鏈霉親和素按一定比例（5:1）耦合構(gòu)建成四聚體。
　　 2. Dot blotting方法檢測HLA-A

3、*0201-β2m-抗原肽、HLA-A*2402-β2m-抗原肽、HLA-A*1101-β2m-抗原肽復(fù)合物單體正確構(gòu)象和生物素化；四聚體染色流式檢測四聚體特異性。
　　 3. 采用淋巴細(xì)胞分離液分離抗凝血的外周血單個核細(xì)胞（PBMC）；序列特異性引物聚合酶鏈反應(yīng)（Sequence Specific Primer Polymerase Chain Reaction，SSP-PCR）分型技術(shù)確定HLa分型。
　　 4. 入

4、選病例用ELISA檢測乙肝五項(xiàng)指標(biāo)，Realtime-PCR 定量檢測HBV DNA。
　　 ELISA檢測排除入選病例HAV、HCV、HDV、HEV、HIV 病毒感染。
　　 5. 應(yīng)用四聚體染色技術(shù)檢測表位特異性CTL的頻率，借助流式細(xì)胞儀檢測多肽體外刺激淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ的能力；流式染色檢測細(xì)胞表面CD 分子的表達(dá)；結(jié)合四聚體染色和細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色檢測細(xì)胞因子（IL-10、TGF-β）的分泌。
　　

5、6. Sigmaplot軟件作圖，SPSS13.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。
　　 結(jié)果：
　　 1. 構(gòu)建了HLA-A*0201 core18-27、pol575-583、env335-343；HLA-A*2402 core117-125、pol756-764；HLA-A*1101 core88-96、preS1 10-17 抗原肽四聚體，所構(gòu)建的七種四聚體都具有較好的特異性。
　　 2. 抗原特異性CTL 在自限性

6、和慢性HBV感染者中頻率和生物學(xué)功能：
　　 (1)自限性HBV感染患者外周循環(huán)中抗原特異性CTL的頻率、增殖能力和分泌IFN-γ的能力明顯高于慢性HBV感染者；自限性HBV感染者外周血中core特異性CTL的頻率高于pol、env特異性CTL 頻率。
　　 (2)在慢性HBV感染者中只有一小部分低病毒滴度的患者抗原特異性CTL 能夠增殖和分泌IFN-γ，高病毒滴度的患者幾乎喪失了抗原特異性CTL細(xì)胞增殖和分泌IFN-γ

7、的能力；統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果顯示：慢性HBV感染者外周血中HBV特異性CTL的頻率同HBV DNA 及ALT 并沒有顯著相關(guān)性（p>0.05）。
　　 (3)HLA-A*0201/HLA-A*2402，HLA-A*0201/HLA-A*1101，HLA-A*1101/HLA-A*2402 限制性自限性HBV感染患者外周循環(huán)中抗原特異性CTL的頻率均高于慢性HBV感染者，慢性HBV感染者外周血抗原特異性CTL 頻率很低，而且和HLA型別

8、沒有顯著相關(guān)性。
　　 3. 自限性和慢性HBV感染者CD8+T細(xì)胞上CD127的表達(dá)頻率沒有顯著性差異，而在慢性HBV感染者特異性CTL 上CD127的表達(dá)要高于自限性感染組，統(tǒng)計學(xué)分析有顯著性差異（p<0.05）。
　　 4. 自限性、慢性HBV感染者和未感染HBV 者外周血CD3+CD4+T細(xì)胞、CD3+CD8+T細(xì)胞的頻率和CD4+/CD8+的比值統(tǒng)計學(xué)分析沒有顯著性差異（p>0.05）。
　　 5.外周

9、血中CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞分泌IL-10、TGF-β、IFN-γ能力在自限性或慢性HBV感染中均無顯著性差異（p>0.05）。
　　 6. 在自限性和慢性HBV感染中，阻斷IL-10/IL-10R 或TGF-β/TGF-βR 相互作用后，抗原特異性CTL的頻率、分泌IFN-γ的能力均增加，特別是阻斷TGF-β/TGF-βR相互作用后，抗原特異性CTL的頻率、分泌IFN-γ的能力增加較強(qiáng)。
　　 結(jié)論：
　　

10、 1. 構(gòu)建的七種四聚體都具有較好的特異性，能夠檢測到表位特異性CTL。
　　 2. 在自限性HBV感染者外周血中這七種抗原特異性CTL的頻率、體外抗原肽刺激后的增殖能力及分泌IFN-γ的能力均較慢性感染者高；慢性HBV感染患者外周血中抗原特異性CTL 頻率一般較低，甚至檢測不到；只有一小部分低病毒滴度的患者外周血中抗原特異性CD8+T 能夠增殖和分泌IFN-γ，高病毒滴度的患者幾乎喪失了抗原特異性CD8+T細(xì)胞增殖和分泌IF

11、N-γ的能力。
　　 3.細(xì)胞因子IL-10和TGF-β在HBV感染者T細(xì)胞應(yīng)答低下、抗原特異性CTL功能耗竭中起作用。體外阻斷IL-10/IL-10R 或TGF-β/TGF-βR 相互作用可以提高抗原特異性CTL的頻率、分泌IFN-γ的能力。
　　 本研究的創(chuàng)新點(diǎn)：
　　 1. 應(yīng)用現(xiàn)有文獻(xiàn)報道的表位，結(jié)合四聚體技術(shù)對不同HLA 限制性表位特異CTL在中國自限性和慢性HBV感染者中頻率和生物學(xué)功能進(jìn)行了初步研究

12、，特別對在中國具有較高頻率HLA-A*2402和HLA-A*1101 限制性CTL的研究。并分析了HLA-A*0201/HLA-A*2402，HLA-A*0201/HLA-A*1101，HLA-A*1101/HLA-A*2402 限制性自限性和慢性HBV感染者體內(nèi)抗原特異CTL 頻率和優(yōu)勢表位。
　　 2.對IL-10、TGF-β等抑制性細(xì)胞因子在HBV特異性CTL 功能耗竭機(jī)制進(jìn)行了初步研究，并通過體外實(shí)驗(yàn)阻斷IL-10/IL

13、-10R 或TGF-β/TGF-βR 相互作用可以提高病毒特異性CTL的頻率和功能，為慢性感染免疫治療提供新的治療靶點(diǎn)。
　　 本研究的意義：
　　 1. 應(yīng)用四聚體染色技術(shù)系統(tǒng)分析了不同HLA限制性不同表位肽特異性CTL 在自限性和慢性HBV感染者的頻率及生物學(xué)功能，有助于我們更全面理解HBV特異CTL在HBV 致病機(jī)理中的作用，也有利于HBV 治療性疫苗的研制。
　　 2.對HBV感染中抗原特異性T細(xì)胞功能失