應用表達譜芯片技術研究甲強龍對小鼠神經干細胞體外增殖能力影響.pdf

1、研究背景與目的:
　　 脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)是一種嚴重危害人類健康的疾病，也是骨科領域常見的疾病。近年來隨著交通和建筑業(yè)的發(fā)展，SCI的發(fā)生率每年都在上升，據統(tǒng)計，迄今為止全世界約有2500萬脊髓損傷患者，且每年新增病例超過13萬。根據我國2002年的一份調查顯示我國脊髓損傷發(fā)病率約為60/106，平均住院時間為189天，平均住院費用約為27萬元。脊髓損傷的后果嚴重，輕者喪失勞動能力，重者癱瘓

2、、大小便失禁、喪失生活自理能力，給家庭和社會帶來沉重的經濟負擔。
　　 隨著生物醫(yī)學的發(fā)展，干細胞特別是神經干細胞在脊髓損傷領域的研究，給脊髓損傷的治療帶來了新的希望。近年來，越來越多的學者開始關注脊髓內源性神經干細胞在脊髓損傷修復中的作用，內源性神經干細胞在脊髓損傷后的動員調節(jié)機制成為一個新的研究熱點。
　　 早在十余年前已有研究證實了脊髓內存在能夠自我更新和多向分化的祖細胞，也即內源性神經干細胞(Endogenous

3、 neural stem cells)。而進一步的實驗研究表明脊髓內源性神經干細胞絕大多數存在于室管膜和室管膜下區(qū)，并且研究顯示脊髓損傷后該區(qū)域的內源性神經干細胞會發(fā)生類似“激活”現象——快速增殖，并可以向損傷附近區(qū)域遷移，分化。進一步研究表明，脊髓損傷后內源性神經干細胞可以發(fā)生遷移并逐漸分化為神經系統(tǒng)的三種主要細胞：神經元、星形膠質細胞、少突膠質細胞，且分化方向并不固定，而是由內源性神經干細胞所處的環(huán)境決定的。
　　 甲強龍是

4、目前常用的臨床治療急性脊髓損傷的藥物，大劑量甲潑尼龍注射治療(megadose of methylprednisolone，MP)，已經被美國脊椎損傷協會(AmericanSpinal Injury Association，ASIA)列為SCI后的常規(guī)治療之一。甲強龍可抑制脊髓損傷后各種炎癥細胞的激活和增殖，減少各種炎癥因子及自由基的產生，從而降低損傷后炎癥反應的水平，抑制脂質過氧化作用，減輕繼發(fā)性損傷，保護神經功能。然而隨著脊髓內源性

5、神經干細胞相關研究的深入，有相關研究發(fā)現甲強龍在脊髓損傷后的應用不僅可以抑制炎癥細胞的激活等一些炎癥反應，還會抑制脊髓損傷后內源性神經干細胞的增殖動員，但就這一抑制作用的機制解釋尚未達成的共識。
　　 本研究的思路是用甲強龍干預體外培養(yǎng)的NSCs，與正常培養(yǎng)的NSCs對比，觀察其對體外培養(yǎng)的NSCs增殖的影響，并進一步用表達譜芯片技術篩選受甲強龍影響表達發(fā)生變化的基因，從而進一步研究甲強龍抑制NSCs增殖的可能機制。目前國內外雖

6、然在該方面有研究，但研究較少，尚未達成共識，且本研究中采用小鼠全基因組表達譜芯片，能較為全面的篩選受藥物影響的表達發(fā)生變化的基因，為下一步分析甲強龍抑制NSCs增殖的機制提供比較全面科學的依據。本研究內容包括三部分：第一部分：小鼠神經干細胞的分離、體外培養(yǎng)和鑒定；第二部分：甲強龍對小鼠神經干細胞體外增殖能力影響的實驗研究；第三部分：應用表達譜芯片技術研究甲強龍抑制神經干細胞增殖能力的可能機制。
　　 研究方法:
　　 取

7、孕14.5d胎鼠，顯微鏡下分離取出胚胎腦組織，剔除腦膜、血管，用DMEM/F12(添加EGF、bFGF、B27和肝素)培養(yǎng)基培養(yǎng)NSCs，細胞培養(yǎng)至第2代，常規(guī)進行免疫細胞化學鑒定。用甲強龍干預體外培養(yǎng)的NSCs作為實驗組，以正常培養(yǎng)的NSCs為對照，用顯微鏡觀察、細胞計數及CCK-8法在不同的時間點檢測細胞增殖狀態(tài)，判斷甲強龍對NSCs增殖能力的影響。繪制細胞增殖曲線并進行統(tǒng)計分析。用甲強龍干預的NSCs和正常培養(yǎng)的NSCs作為實驗組

8、和對照組，用Trizol一步法提取細胞總RNA，樣本RNA進行熒光標記后，與小鼠全基因組表達譜芯片進行雜交，然后進行芯片掃描，數據處理與分析。了解受甲強龍影響表達發(fā)生變化的基因，分析推斷其影響NSCs增殖的可能機制。
　　 結果:
　　 1.分離培養(yǎng)的細胞為懸浮呈神經球樣生長，經過免疫細胞化學鑒定，Nestin染色陽性；5％胎牛血清誘導分化后，Tuj-1，O4，GFAP染色陽性，可以確定細胞為NSCs。
　　 2

9、.顯微鏡下觀察甲強龍對NSCs增殖能力的影響，可見加強龍組的NSCs增殖速度明顯不及對照組，細胞接種后第3～4d即可見明顯差別。細胞計數結果同樣提示甲強龍干預后細胞增殖受到抑制，統(tǒng)計學分析結果顯示實驗組和對照組之間有統(tǒng)計學差異。CCK-8法檢測結果提示甲強龍可以導致NSCs增殖受抑制，且隨著藥物濃度的提高，該抑制作用逐漸增強。
　　 3.表達譜芯片檢測實驗組和對照組RNA樣本，共得到的143個表達差異基因。其中110個表達上調基

10、因，明顯上調的有12個；33個表達下調基因，明顯下調的8個。表達下調的基因中內皮素受體B(endothelin receptors B，EndrB)下調明顯，Ratio值為0.363。推斷EndrB下調為甲強龍抑制NSCs增殖的可能原因。
　　 結論:
　　 1.體外培養(yǎng)小鼠NSCs的方法簡單可行，細胞體外擴增速度快，免疫細胞化學染色熒光信號明顯，可以確定細胞為NSCs。
　　 2.細胞計數結果和CCK-8法檢測