GM1、NGF對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞體外增殖和分化的影響研究.pdf

1、目的：觀察神經(jīng)干細(xì)胞體外培養(yǎng)，通過(guò)實(shí)驗(yàn)掌握神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化過(guò)程培養(yǎng)液的條件，了解神經(jīng)干細(xì)胞生長(zhǎng)的相關(guān)影響因素；觀察神經(jīng)節(jié)苷脂（GM1）和鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）兩種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)藥物對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化的影響，探討藥物的有效劑量，闡明藥物與培養(yǎng)液成分之間的相互關(guān)系；為今后臨床神經(jīng)干細(xì)胞移植后續(xù)藥物治療奠定基礎(chǔ)，為臨床應(yīng)用干細(xì)胞治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的綜合治療提出科學(xué)依據(jù)。 方法：1.從胎鼠脊髓分離體外培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞；2.將含有表皮生長(zhǎng)因子

2、(Epidermal Growth Factor，EGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic Fibroblast Growth Factor，bFGF)的NSCs完全培養(yǎng)液，及不含bFGF、EGF的DMEM/F12培養(yǎng)液作為兩種不同的培養(yǎng)介質(zhì)，分別加入不同濃度的GM1和NGF。3.顯微鏡下觀察神經(jīng)干細(xì)胞體外增殖，應(yīng)用MTT法（Methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）和細(xì)胞球計(jì)數(shù)，分析上述藥物添加前后NSCs

3、增殖情況；4.應(yīng)用免疫組化法及Western blot法分析上述藥物添加前后表達(dá)各種細(xì)胞因子的細(xì)胞體積和數(shù)量的改變。 結(jié)果：1.細(xì)胞培養(yǎng)5-7d后，細(xì)胞生長(zhǎng)為數(shù)十到數(shù)百個(gè)細(xì)胞的懸浮球形克隆。2.細(xì)胞球計(jì)數(shù)和MTT測(cè)定結(jié)果表明，在含有bFGF、EGF的NSCs培養(yǎng)液中，較高濃度GM1條件下，干細(xì)胞增殖明顯（P<0.05）。3.免疫組化結(jié)果顯示，GM1濃度增加，Nestin表達(dá)細(xì)胞體積增大，NGF組表達(dá)神經(jīng)元特異性烯醇化酶(Neur

4、o Specific Enolase，NSE)、血清膠質(zhì)纖維酸性蛋白(Glial Fibrillary Acidic Protein,GFAP)的細(xì)胞比率增加。Western blot 顯示GM1組Nestin表達(dá)明顯，而NGF組GFAP和NSE表達(dá)明顯。 結(jié)論：1.神經(jīng)干細(xì)胞體外培養(yǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)良好。2.GM1對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖有影響，且有一定的量效關(guān)系，高濃度GM1能促進(jìn)NSCs增殖。3.NGF能促進(jìn)NSCs分化，且有一定的量