哮喘大鼠氣道平滑肌肌漿網(wǎng)鈣泵和磷酸受納蛋白的表達(dá)及藥物的干預(yù)作用.pdf

1、支氣管哮喘(Asthma或Bronchial Asthma)是一種以氣流可逆性阻塞、氣道慢性炎癥、氣道高反應(yīng)性為特征的復(fù)雜的炎癥性疾病,是嚴(yán)重影響人們健康的常見(jiàn)病、多發(fā)病.哮喘發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜,但不管何種機(jī)制,所引起的支氣管哮喘的發(fā)生都是和氣道平滑肌(airway smooth muscle,ASM)的結(jié)構(gòu)和功能異常是分不開(kāi)的.鈣是引起平滑肌收縮的關(guān)鍵物質(zhì),胞漿游離鈣濃度([Ca<'2+>]i)下降會(huì)產(chǎn)生平滑肌絲的松弛.在氣道平滑肌中,

2、肌漿網(wǎng)Ca<'2+>-ATP酶(SERCA)將胞漿內(nèi)鈣離子攝入肌漿網(wǎng)內(nèi),是[Ca<'2+>]i下降的主要途徑.氣道平滑肌主要表達(dá)SERCA2b同工型鈣泵.SERCA2b活性大部分則由磷酸受納蛋白(Plaospholambam,PLB)調(diào)節(jié).國(guó)內(nèi)外均有研究顯示,SERCA和PLB基因及蛋白表達(dá)的改變導(dǎo)致心肌細(xì)胞收縮功能受損,而應(yīng)用β受體阻滯劑能增加受損心肌SERCA基因及蛋白的表達(dá),同時(shí)減少PLB基因和蛋白的表達(dá),從而部分恢復(fù)心肌細(xì)胞的正

3、常收縮功能.那么,在哮喘的發(fā)病過(guò)程中,氣道平滑肌SERCA和PLB基因及蛋白表達(dá)的改變是否也發(fā)揮了一定的作用?哮喘治療藥物長(zhǎng)效β2受體激動(dòng)劑和吸入用糖皮質(zhì)激素治療哮喘機(jī)制是否有氣道平滑肌SERCA和PLB基因及蛋白表達(dá)的改變參與其內(nèi)?這些問(wèn)題尚需實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討. 目的:采用主動(dòng)致敏后重復(fù)抗原攻擊的大鼠為哮喘模型,觀察氣道平滑肌SERCA和PLB基因及蛋白表達(dá)的改變.并且在動(dòng)物模型上應(yīng)用選擇性SERCA抑制劑環(huán)匹阿尼酸,觀察其療效

4、,以確定其在哮喘發(fā)病機(jī)制中的作用.應(yīng)用長(zhǎng)效β<,2>受體激動(dòng)劑和吸入用糖皮質(zhì)激素,觀察療效,探討它們治療哮喘機(jī)制是否有SERCA和PLB基因及蛋白表達(dá)的改變參與其內(nèi). 方法:將清潔級(jí)健康雄性SD大鼠48只,隨機(jī)分為六組,每組8只,即福莫特羅組、布地奈德組、福莫特羅+布地奈德組、環(huán)匹阿尼酸組、對(duì)照組、模型組.通過(guò)卵白蛋白致敏及攻擊后建立大鼠哮喘模型,并在每次攻擊前,相應(yīng)將各組用藥?kù)F化吸入.最后一次霧化24小時(shí)后,進(jìn)行肺功能測(cè)定,并

5、計(jì)算肺阻力,肺動(dòng)態(tài)順應(yīng)性.大鼠放血處死后,進(jìn)行肺泡灌洗,計(jì)數(shù)肺泡灌洗液(BALF)中白細(xì)胞總數(shù)和嗜酸性粒細(xì)胞比例,取肺組織進(jìn)行病理切片以觀察肺組織炎癥情況.分離氣管平滑肌用TRIZOL提取總RNA,RT-PCR法半定量測(cè)定支氣管平滑肌中SERCA和PLB mRNA的表達(dá)水平;用蛋白裂解液提取總蛋白,用Westernblot法半定量測(cè)定支氣管平滑肌中SERCA和PLB蛋白的表達(dá)水平. 結(jié)果: 1.大鼠哮喘模型建立:模型組大

6、鼠經(jīng)抗原攻擊后測(cè)肺功能,肺阻力較對(duì)照組明顯升高(P<0.01),肺動(dòng)態(tài)順應(yīng)性則顯著下降(P<0.01);氣道內(nèi)出現(xiàn)了以嗜酸性粒細(xì)胞(Eos)浸潤(rùn)為主的炎癥反應(yīng),表現(xiàn)為BALF中Eos計(jì)數(shù)較對(duì)照組明顯升高(P<0.01);病理切片也發(fā)現(xiàn)平滑肌增生肥厚,間質(zhì)嗜酸性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯增多.以上均為大鼠哮喘模型的基本特征,提示哮喘模型建立成功. 2.藥物治療影響:①哮喘大鼠經(jīng)福莫特羅、布地奈德治療后,與模型組相比,肺動(dòng)態(tài)順應(yīng)性均明

7、顯上升(P<0.01),肺阻力也都有顯著下降(P<0.01),兩藥聯(lián)用組雖然也有明顯的肺功能改善(P<0.01),但較單一用藥效果差異不顯著.環(huán)匹阿尼酸治療組肺功能則無(wú)明顯緩解.BALF計(jì)數(shù)結(jié)果顯示布地奈德組(P<0.05)和聯(lián)合治療組(P<0.01)的BALF細(xì)胞總數(shù)明顯較模型組減少;嗜酸性粒細(xì)胞總數(shù)福莫特羅組(P<0.01)、布地奈德組(P<0.01)、福莫特羅+布地奈德組(P<0.01)、環(huán)匹阿尼酸組(P<0.05)均比模型組有明

8、顯下降.以上結(jié)果提示福莫特羅,布地奈德治療有效.②SERCA和PLB基因和蛋白的表達(dá)水平:模型組的SERCA基因和蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組均有明顯上調(diào)(P<0.01);和模型組相比,布地奈德組、聯(lián)合治療組和環(huán)匹阿尼酸組的SERCAmRNA水平有明顯的下降(P<0.05),SERCA蛋白水平也有下降,但統(tǒng)計(jì)無(wú)明顯差異;而福莫特羅組則無(wú)明顯改變.模型組的PLB基因和蛋白表達(dá)水平也較對(duì)照組有明顯上升(P<0.01):布地奈德組和聯(lián)合治療組的PLB

9、基因和蛋白表達(dá)水平較模型組有顯著下調(diào)(P<0.05);而福莫特羅和環(huán)匹阿尼酸組的PLB基因和蛋白表達(dá)水平雖然有下降,但沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異. 結(jié)論:1.大鼠哮喘模型中SERCA、PLB基因和蛋白表達(dá)明顯增加,提示SERCA和PLB基因和蛋白表達(dá)改變參與了哮喘發(fā)病機(jī)制.2.長(zhǎng)效β 2受體激動(dòng)劑福莫特羅對(duì)大鼠氣道平滑肌SERCA、PLB基因和蛋白表達(dá)無(wú)明顯作用.3.吸入型糖皮質(zhì)激素布地奈德對(duì)大鼠氣道平滑肌SERCA、PLB基因表達(dá)有明顯的