哮喘氣道重塑中氣道平滑肌細(xì)胞凋亡的變化及地塞米松的干預(yù)作用.pdf

1、目的：(1)觀察支氣管哮喘大鼠氣道重塑中氣道平滑肌細(xì)胞(ASMCs)凋亡的變化,探討ASMCs凋亡在哮喘氣道重塑中的作用;(2)觀察地塞米松對(duì)ASMCs凋亡的影響并探討其可能機(jī)制. 方法：清潔級(jí)雄性SD大鼠36只,體重125-175g,隨機(jī)分為3組:正常對(duì)照組(C)、哮喘組(A)和地塞米松干預(yù)組(D),每組12只.以卵蛋白(OVA)致敏和激發(fā)的方法制備大鼠慢性哮喘模型.末次激發(fā)24小時(shí)后腹腔注射麻醉,氣管切開(kāi)插管,測(cè)定氣道反應(yīng)性

2、.肺組織HE染色,光鏡下找到完整的支氣管橫斷面,應(yīng)用圖象分析軟件測(cè)定支氣管基底膜周徑(Pbm)、管壁總面積(Wat)、平滑肌面積(Wam),并用Pbm將測(cè)得的Wat和Wam標(biāo)準(zhǔn)化,以Wat/Pbm、Wam/Pbm表示,分別代表管壁厚度和平滑肌厚度.透射電子顯微鏡下觀察肺組織超微結(jié)構(gòu).末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP切口末端標(biāo)記法(TLJNEL法)檢測(cè)ASMCs凋亡并計(jì)算凋亡指數(shù)(AI).免疫組化和原位雜交分別檢測(cè)氣道平滑肌Bc1-2、Bax及其

3、mRNA的表達(dá)情況.熒光免疫組化染色和熒光顯微鏡觀察細(xì)胞色素C(Cytc)在氣道平滑肌的表達(dá)情況. 結(jié)果：(1)氣道反應(yīng)性:靜脈注射不同濃度乙酰甲膽堿(Mch)后,A組大鼠氣道阻力增加幅度和順應(yīng)性下降幅度均明顯高于C組(P<0.01),D組大鼠氣道反應(yīng)性較A組明顯降低(P<0.01或P<0.05),但仍高于C組(P<0.01或P<0.05). (2)肺組織HE染色光鏡觀察:光鏡下C組大鼠支氣管上皮完整,無(wú)明顯炎癥反應(yīng),肺

4、組織形態(tài)正常:A組大鼠可見(jiàn)支氣管上皮脫落,支氣管壁和血管壁周圍有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),基底膜和平滑肌明顯增厚,管腔狹窄;D組炎癥反應(yīng)較輕,氣道壁各層(尤其是平滑肌層)厚度較A組明顯降低. (3)支氣管壁厚度(Wat/Pbm)和平滑肌厚度(Wam/Pbm): C組大鼠Wat/Pbm為63.87±6.34μm<'2>,Wam/Pbm為16.66±1.86μm<'2>/μm;A組大鼠Wat/Pbm(87.18±11.29 μm<'2>/μ

5、m)和Wam/Pbm(34.41±3.93μm<'2>μm)均較C組明顯增高(P<0.01);D組大鼠上述指標(biāo)[Wat/Pbm(74.05±4.60 μm<'2>/μm),Wam/Pbm(25.42±2.52μm<'2>/μm)]均明顯低于A組(P<0.01),但仍高于C組(P<0.01). (4)電鏡觀察: 電鏡下C組顯示正常的肺泡膈和肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞,支氣管平滑肌薄,可見(jiàn)核固縮的ASMCs;A組顯示肺泡膈明顯增厚,支氣管壁大

6、量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),支氣管平滑肌較C組明顯增厚,ASMCs數(shù)量明顯增多,未見(jiàn)核固縮的ASMCs;D組顯示基本正常的肺泡膈和肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞,支氣管壁少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),支氣管平滑肌較薄,可見(jiàn)核固縮的ASMCs. (5)ASMCs凋亡情況: C組大鼠ASMCs的AI為(0.201±0.022);A組大鼠ASMCs的AI為0.030±0.016,低于C組(P<0.01);D組AI為0.118±0.043,與A組比較明顯增高(P<0.01)

7、,但仍低于C組(P<0.01). (6)Bcl-2及其mRNA的表達(dá)情況: C組大鼠氣道平滑肌層Bcl-2表達(dá)的吸光度(OD值)為(0.060±0.012);A組大鼠OD值為0.112±0.028,顯著高于C組(P<0.01);D組OD值為0.080±0.010,明顯低于A組(P<0.01),但仍高于C組(P<0.01).C組大鼠氣道平滑肌層Bcl-2mRNA表達(dá)的0D值為0.065±0.019;A組大鼠OD值為0.157±0.

8、019,顯著高于C組(P<0.01);D組OD值為0.099±0.029,低于A組(P<0.01),但仍高于C組(P<0.01). (7)Bax及其mP,NA的表達(dá)情況: C組大鼠氣道平滑肌層Bax表達(dá)的OD值為0.120±0.020;A組大鼠OD值為0.062±0.012,顯著低于C組(P<0.01);D組OD值為0.093±0.010,明顯高于A組(P<0.01),但仍低于C組(P<0.01).C組大鼠氣道平滑肌層Bax m

9、RNA表達(dá)的OD值為0.155±0.025;A組大鼠OD值為0.074±0.019,顯著低于C組(P<0.01);D組OD值為0.118±0.031,高于A組(P<0.01),但仍低于C組(P<0.01). (8)Cytc表達(dá)情況: Cytc熒光免疫組化染色結(jié)果顯示,A組大鼠氣道平滑肌層熒光強(qiáng)度明顯弱于C組,D組熒光強(qiáng)度較A組增強(qiáng),但仍弱于C組. (9)相關(guān)分析: 相關(guān)分析結(jié)果顯示,ASMCs的AI和氣道平滑肌厚度之間呈

10、顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.860,P<0.01);ASMCs的AI和氣道平滑肌Bcl-2相對(duì)含量呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.783,P<0.01);ASMCs的AI和氣道平滑肌Bax相對(duì)含量呈正相關(guān)(r=0.837,P<0.01). 結(jié)論：(1)哮喘氣道重塑中ASMCs凋亡減少,其凋亡指數(shù)與支氣管平滑肌厚度呈負(fù)相關(guān),ASMCs凋亡的減少可能參與了哮喘氣道重塑過(guò)程; (2)地塞米松可以增加ASMCs的凋亡,從而延緩哮喘氣道重塑的發(fā)