含結(jié)核分枝桿菌Ag85A基因的2型重組腺相關(guān)病毒的構(gòu)建及其免疫原性研究.pdf

1、近年來(lái)隨著流動(dòng)人口的增加、人類(lèi)免疫缺陷病毒與結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，Mtb)并發(fā)感染，以及Mtb多重耐藥菌株的出現(xiàn)等原因，全球結(jié)核病(tuberculosis，TB)疫情再度出現(xiàn)新高。目前全球有超過(guò)20億人感染過(guò)Mtb，每年新發(fā)TB病例超過(guò)800萬(wàn)，同時(shí)每年約有200～300萬(wàn)人死于TB，TB已成為世界上最嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一。我國(guó)是世界上TB疫情非常嚴(yán)重的國(guó)家，發(fā)病率排名世界第二，占全球所

2、有TB病例的1 5％左右，流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示我國(guó)TB疫情相當(dāng)嚴(yán)重，主要表現(xiàn)為結(jié)核菌感染人數(shù)多、現(xiàn)患肺結(jié)核病人多、結(jié)核病死亡人數(shù)多、農(nóng)村結(jié)核病人多和傳染性肺結(jié)核病疫情居高不下等特征。顯然，要降低TB的發(fā)病率的就必須從根本上降低TB的傳播速度，目前有效控制TB蔓延的主要策略有兩方面：(1)活動(dòng)性TB的快速診斷和及時(shí)治療；(2)使用有效的疫苗阻止疾病的發(fā)生。因此，研制新型Mtb疫苗和尋求有效的治療活動(dòng)性TB的手段迫在眉睫。 Ag85

3、A作為一種能激活機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)能力的Mtb分泌蛋白、2型重組腺相關(guān)病毒(recombinant adeno-associatedvirus type 2，rAAV-2)載體作為一種能有效轉(zhuǎn)導(dǎo)多種組織和細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移工具，均在各自的領(lǐng)域引起了人們的高度重視。為此，本研究以研制新型Mtb疫苗為目的，構(gòu)建了表達(dá)Ag85A的rAAV-2(rAAV-2-Ag85A)，初步研究了其免疫原性，旨在為研制Mtb疫苗提供較為理想的候選株。采用

4、PCR法，以結(jié)核桿菌H37Rv株基因組DNA為模板擴(kuò)增Ag85A基因；將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物插入rAAV-2表達(dá)質(zhì)粒pSNAV-2中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pSNAV-Ag85A；用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BHK-21細(xì)胞中，G418篩選得到轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒并能表達(dá)目的基因細(xì)胞系BHK-Ag85A；用具有rAAV包裝功能的重組單純皰疹病毒感染BHK-Ag85A，純化后得到rAAV-2-Ag85A；用高效液相色譜儀(HPLC)檢測(cè)rAAV-2-Ag85

5、A的純度；以點(diǎn)雜交方法檢測(cè)重組病毒的物理滴度；Western blot檢測(cè)重組病毒在體外的表達(dá)。結(jié)果顯示，PCR擴(kuò)增的序列與Gene Bank公布的Ag85A序列(AY732095)完全一致；分離純化后得到的rAAV-2-Ag85A HPLC分析顯示主峰為總面積大于99％；點(diǎn)雜交檢測(cè)rAAV-2-Ag85A 的物理滴度為2×10<'12> virusparticles/ml(vp/ml)；Western blot檢測(cè)rAAV-2-Ag8

6、5A在體外感染的BHK-21細(xì)胞顯示出一條32kD的雜交帶，該雜交帶的位置與DNAStar軟件分析的結(jié)果相符。提示已經(jīng)獲得了在體外能有效地感染培養(yǎng)細(xì)胞的、能滿(mǎn)足疫苗使用需要的高滴度、高純度的rAAV-2-Ag85A，為下一步工作奠定了基礎(chǔ)。 本研究首次報(bào)道了rAAV-2載體介導(dǎo)Mtb抗原基因用于Mtb疫苗的研究。為觀察rAAV-2-Ag85A在體內(nèi)的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，通過(guò)滴鼻(intranasal，in)的途徑給予Balb/c小鼠5×1

7、 0<'11> vp/ml的rAAV-2-Ag85A三周后，用RT-PCR擴(kuò)增肺組織中Ag85A基因cDNA、Western blot檢測(cè)肺組織中Ag85A的表達(dá)。分別通過(guò)肌肉注射和滴鼻途徑用rAAV-2-Ag85A免疫Balb/C小鼠，ELISA法檢測(cè)血清中抗-Ag85A抗體的滴度和mlFN-γ的含量，<'51>Cr釋放分析檢測(cè)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)活性，以比較兩種不同免疫途徑的免疫效能。結(jié)果顯示，RT-PCR可從小鼠肺組織擴(kuò)增

8、出一條約 Kb的條帶，其長(zhǎng)度與預(yù)期結(jié)果一致；Western Blotting檢測(cè)到rAAV-2-Ag85A在肺組織的表達(dá)產(chǎn)物；無(wú)論是通過(guò)肌肉注射途徑還是經(jīng)鼻粘膜免疫，在加強(qiáng)免疫后的第10天就能刺激小鼠體內(nèi)產(chǎn)生特異性抗體、激發(fā)抗原特異性CTL的出現(xiàn)、還可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生Th1 型細(xì)胞因子IFN-γ；除在個(gè)別時(shí)相點(diǎn)肌注免疫組CTL活性、IFN-γ的含量(均為加強(qiáng)免疫后第10天)明顯高于滴鼻免疫組外，其它時(shí)相點(diǎn)兩組的抗體滴度、CTL活性和IFN-

9、γ的含量均無(wú)明顯差異，且它們?cè)趦山M中的變化趨勢(shì)基本一致。表明rAAV-2不僅能介導(dǎo)外源性Ag85A基因轉(zhuǎn)移到小鼠肺細(xì)胞，還能有效地轉(zhuǎn)錄和翻譯。通過(guò)肌肉注射途徑和經(jīng)鼻粘膜免疫均可以誘導(dǎo)體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)的同時(shí)出現(xiàn)、刺激機(jī)體產(chǎn)生IFN-γ。說(shuō)明除了通過(guò)刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性抗體而具有預(yù)防Mtb感染的功能之外，rAAV-2-Ag85A也能通過(guò)增強(qiáng)宿主Th1型免疫反應(yīng)而對(duì)TB有一定免疫治療作用，因而作為 TB 的治療性疫苗可能也同樣具有潛在的應(yīng)用價(jià)