結(jié)核分枝桿菌Rv1419DNA疫苗的構(gòu)建及免疫原性研究.pdf

1、結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌感染引起的世界性傳染病，尤其是在發(fā)展中國(guó)家形勢(shì)更加嚴(yán)峻，我國(guó)是世界上結(jié)核病發(fā)病率最高的22個(gè)國(guó)家之一，結(jié)核病患病人數(shù)僅次于印度，位居第二?？ń槊缡悄壳拔ㄒ粦?yīng)用于結(jié)核的預(yù)防性疫苗，但對(duì)于成人肺結(jié)核的保護(hù)效力十分有限，再加上其自身的不足以及外界因素的變化，研制新型的結(jié)核疫苗對(duì)于結(jié)核病的防治來(lái)講顯得尤為重要。
　　DNA疫苗是一種常見(jiàn)的基因疫苗，1993年Ulmer等首篇研究報(bào)道發(fā)表在Science上之后，該發(fā)現(xiàn)立

2、即被視為疫苗領(lǐng)域的一場(chǎng)革命，開(kāi)辟了疫苗研究的新時(shí)代。從此，基因疫苗成為世界矚目的防治傳染病的研究新熱點(diǎn)。
　　本研究應(yīng)用分子克隆技術(shù)構(gòu)建新型的結(jié)核分枝桿菌DNA疫苗，即pVAX1-Rv1419重組質(zhì)粒，并評(píng)價(jià)了該疫苗在小鼠體內(nèi)的免疫原性。
　　一、Rv1419基因真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
　　以H37Rv基因組為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增rv1419基因，獲得長(zhǎng)401bp的rv1419基因片段，回收目的基因片段插入pGEM-T載體

3、中，經(jīng)酶切鑒定與序列測(cè)定證實(shí)后，雙酶切回收目的基因片段，再與雙酶切后的真核表達(dá)載體pVAX1連接，構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-Rv1419。重組真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-Rv1419經(jīng)酶切鑒定及基因測(cè)序證實(shí)構(gòu)建成功。應(yīng)用金牌超量無(wú)內(nèi)毒素試劑盒大量提取并純化質(zhì)粒DNA。
　　二、Rv1419DNA疫苗在小鼠體內(nèi)的免疫原性評(píng)價(jià)
　　將50只BALB/c雌性小鼠隨機(jī)分為5組，每組10只，分別用生理鹽水、pVAX1載體、微卡菌苗、Ag

4、85A DNA疫苗、Rv1419 DNA疫苗免疫，通過(guò)雙側(cè)脛前肌注射的方法免疫小鼠，每2周免疫1次，共免疫3次，第3次免疫后3周殺死小鼠。通過(guò)ELISA方法檢測(cè)血清中抗Rv1419的IgG抗體;利用ELISA方法檢測(cè)小鼠脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ和IL-4表達(dá)水平;應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血單個(gè)核細(xì)胞內(nèi)分泌IFN-γ的Th1和分泌IL-4的Th2細(xì)胞百分比以及Th1/Th2比值。結(jié)果顯示Rv1419 DNA疫苗免疫的小鼠特異性抗體Ig

5、G高于生理鹽水組和載體質(zhì)粒組(p＜0.05)，與微卡菌苗組無(wú)顯著性差異。Rv1419DNA疫苗組脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ水平顯著高于生理鹽水組、載體質(zhì)粒組和微卡菌苗組(p＜0.05)，但低于Ag85A DNA疫苗組。Rv1419 DNA疫苗組Th1細(xì)胞百分比顯著高于生理鹽水組和載體組(p＜0.01)，且Th1/Th2細(xì)胞比值顯著高于生理鹽水組和載體組(p＜0.01)，與微卡菌苗組和Ag85A DNA疫苗組無(wú)顯著性差異。