結(jié)核分枝桿菌Ag85B-Esat6-HspX融合基因DNA疫苗的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、結(jié)核病(Tuberculosis,TB)是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)引起的傳染性疾病。據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道,目前全球有近1/3的人感染了結(jié)核桿菌。隨著多重耐藥菌、極度耐藥株的出現(xiàn),艾滋病與結(jié)核共感染人群的增加使得活動(dòng)性結(jié)核病人日益增多。
　　 目前,卡介苗是唯一獲得批準(zhǔn)的被廣泛使用的結(jié)核病預(yù)防疫苗,對(duì)于兒童卡介苗具有良好的保護(hù)效果,但對(duì)于成人其保護(hù)效果不容樂(lè)觀,對(duì)于抑制潛伏期結(jié)核

2、的復(fù)發(fā)更是毫無(wú)作用。因此研制新的結(jié)核病疫苗迫在眉睫,未來(lái)的結(jié)核病疫苗不僅要對(duì)剛出生嬰兒以及未感染結(jié)核菌的人群提供良好的預(yù)防作用,對(duì)于已經(jīng)感染結(jié)核菌但尚未發(fā)病的感染人群也要具有增強(qiáng)細(xì)胞免疫、加速清除結(jié)核菌的保護(hù)作用。
　　 本研究用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建了結(jié)核分枝桿菌Ag85B-Esat6-HspX融合基因,并對(duì)其在體外真核細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。應(yīng)用此疫苗在小鼠體內(nèi)進(jìn)行了免疫原性評(píng)價(jià),同時(shí)觀察了此疫苗的預(yù)防保護(hù)效果和治療效果。
　　

3、 一、Ag85B-Esat6-HspX融合基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其表達(dá)
　　 用PCR法從結(jié)核分枝桿菌H37Rv株基因組中分別擴(kuò)增Ag85B、Esat6、HspX基因,插入到pUC19-T載體,序列測(cè)定正確后,將融合基因再次克隆到真核表達(dá)載體pcDNA3.1(-)。重組質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定并測(cè)序正確后,應(yīng)用MegaTran1.0瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,用抗Ag85B的多克隆抗體、抗Esat6的單克隆抗體和抗HspX的單克隆抗體分別進(jìn)行

4、Western-Blot檢測(cè),均能檢測(cè)到分子量大小約65 kDa的目的蛋白。這種成功構(gòu)建的能夠在真核細(xì)胞表達(dá)融合蛋白的重組質(zhì)粒為后期進(jìn)行的免疫原性評(píng)價(jià)和保護(hù)力評(píng)價(jià)奠定了基礎(chǔ)。
　　 二、Ag85B-Esat6-HspX融合基因DNA疫苗的免疫原性評(píng)價(jià)
　　 將上述融合基因DNA疫苗免疫小鼠對(duì)其免疫原性進(jìn)行初步評(píng)價(jià)。BALB/c小鼠進(jìn)行一側(cè)股四頭肌肌肉注射免疫,每次100μl/只,間隔2周免疫一次,共免疫3次,同時(shí)設(shè)BCG

5、組、空質(zhì)粒免疫組(pcDNA)和pHspX免疫組。在免疫的第2周,第4周及最后一次免疫后2周檢測(cè)小鼠血清中的總IgG水平。末次免疫后2周,小鼠摘眼球取血,進(jìn)行CD4+,CD8+和γδT細(xì)胞比例測(cè)定；無(wú)菌取脾分離小鼠脾淋巴細(xì)胞,檢測(cè)小鼠血清中針對(duì)HspX蛋白的特異性IgG2a和IgC1比值；體外用HspX抗原刺激小鼠脾淋巴細(xì)胞后,通過(guò)淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)和ELISPOT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖能力和脾淋巴細(xì)胞中能分泌抗原特異性IFN-γ的

6、細(xì)胞數(shù)量;應(yīng)用ELISA法檢測(cè)小鼠脾淋巴細(xì)胞IFN-γ、IL-2和IL-4分泌水平。在體液免疫應(yīng)答中,融合基因DNA疫苗誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生的血清總IgG OD值均高于其他三組(P<0.05),且抗體亞類以Th1型的IgG2a為主(P<0.05)。在細(xì)胞免疫應(yīng)答中,融合基因DNA疫苗組小鼠的脾淋巴細(xì)胞特異性增殖明顯,指數(shù)為2.33,顯著高于BCG組的增殖指數(shù)1.26(P<0.05)。應(yīng)用Ag85B、Esat6和HspX抗原體外刺激后,融合基因疫

7、苗組脾淋巴細(xì)胞分泌特異性IFN-γ的細(xì)胞數(shù)量均明顯高于其他三組(P<0.01)。融合基因疫苗可使CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞明顯增殖,所占比例分別為27.58％和8.64％,但與BCG免疫小鼠相比,差異無(wú)顯著性(P>0.05)。外周血γδT細(xì)胞比例,四個(gè)組均無(wú)差異(P>0.05)。融合基因疫苗組的IFN-γ和IL-2的水平分別為1005.72±67.12 pg/ml和84.63±8.76pg/ml,明顯高于其他三組(P<0.05),但

8、四個(gè)組均未檢出IL-4含量。
　　 三、Ag85B-Esat6-HspX融合基因DNA疫苗的效力學(xué)評(píng)價(jià)
　　 DNA疫苗對(duì)MTB感染小鼠的預(yù)防保護(hù)效果:小鼠末次免疫完成后2周,用5×105 CFU結(jié)核分枝桿菌H37Rv通過(guò)尾靜脈注射的方式感染,6周后無(wú)菌分離小鼠的脾和肺,計(jì)數(shù)脾肺組織的細(xì)菌荷菌量,以log10CFU表示。結(jié)果表明,空質(zhì)粒對(duì)照組小鼠的脾肺荷菌量分別為5.48±0.11 log10和5.40±0.09 log

9、10,融合基因疫苗組小鼠的脾肺荷菌量分別為4.97±0.05 log10和4.65±0.22 ioglo,二者比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),提示融合基因疫苗對(duì)MTB感染小鼠有明顯的保護(hù)作用,但其保護(hù)作用與BCG相比差異無(wú)顯著性(P>0.05),BCG免疫小鼠的脾肺荷菌量分別為4.88±0.13log10和4.46±0.17 log10。
　　 DNA疫苗對(duì)MTB感染小鼠的治療效果:小鼠經(jīng)5×105 CFU結(jié)核分枝桿菌H37R

10、v尾靜脈感染4周后,再給小鼠肌肉注射重組質(zhì)粒DNA(1μg/μl),每次100μl/只,間隔2周注射一次,共注射3次,同時(shí)設(shè)空質(zhì)粒治療組(pcDNA)和pHspX治療組。本研究中的治療效果實(shí)驗(yàn)并未設(shè)置BCG陽(yáng)性對(duì)照組因?yàn)樵谟贐CG對(duì)于結(jié)核菌感染后人群并無(wú)保護(hù)效果。末次注射后6周,無(wú)菌分離小鼠的脾肺,計(jì)數(shù)脾肺組織的細(xì)菌荷菌量,以log10CFU表示。結(jié)果表明,MTB感染小鼠經(jīng)注射空質(zhì)粒后,脾肺荷菌量分別為5.43±0.11 log10和5

11、.46±0.08 log10而注射融合基因質(zhì)粒DNA組小鼠的脾肺荷菌量分別為4.88±0.18 log10和4.92±0.10 log10,二者比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),提示融合基因疫苗對(duì)MTB感染小鼠有一定的治療作用。
　　 四、結(jié)論:
　　 本研究首次將結(jié)核分枝桿菌休眠期抗原HspX與生長(zhǎng)早期抗原Ag85B和ESAT-6聯(lián)合使用,成功構(gòu)建了能夠在真核細(xì)胞表達(dá)融合蛋白的重組質(zhì)粒pcDNA-Ag85B-Esat6

12、-HspX。
　　 我們對(duì)這種新型DNA疫苗分別進(jìn)行了免疫原性和效力學(xué)評(píng)價(jià),發(fā)現(xiàn)此疫苗可在小鼠體內(nèi)刺激產(chǎn)生較強(qiáng)的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答,具有較強(qiáng)的免疫原性。通過(guò)先免疫后感染的方式,對(duì)此疫苗進(jìn)行了預(yù)防保護(hù)效果評(píng)價(jià),發(fā)現(xiàn)融合基因DNA疫苗可以顯著減少小鼠體內(nèi)脾肺荷菌量,但這種保護(hù)作用并不能超過(guò)BCG。同時(shí),通過(guò)先感染后免疫的方式,對(duì)此疫苗進(jìn)行了治療效果的評(píng)價(jià),發(fā)現(xiàn)此融合基因DNA疫苗也具有一定的治療作用。所以,與傳統(tǒng)的BCG相比,此新型