玉米原位轉(zhuǎn)化體系建立及轉(zhuǎn)化機(jī)制初步分析.pdf

1、近年來(lái)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物原位(InPlanta)轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系已廣泛用于擬南芥、白菜、油菜、苜蓿等多種植物的轉(zhuǎn)化中,但在單子葉植物玉米上的應(yīng)用少見(jiàn)報(bào)道。本研究以玉米骨干自交系鄭58作為轉(zhuǎn)化受體材料,應(yīng)用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),研究建立玉米原位轉(zhuǎn)化體系并進(jìn)行技術(shù)參數(shù)優(yōu)化;同時(shí)利用GUS報(bào)告基因的瞬時(shí)表達(dá)技術(shù)分析了玉米原位轉(zhuǎn)化中農(nóng)桿菌侵染途徑及位置等。獲得如下主要結(jié)果:
　　1.初步建立了玉米原位轉(zhuǎn)化體系,主要流程如下:A.農(nóng)桿菌培養(yǎng)及轉(zhuǎn)化液制備

2、;B.原位轉(zhuǎn)化:在玉米初花期(雌穗花絲露出苞葉3-5cm,雄穗未散粉),將農(nóng)桿菌菌液注入雌穗,待成熟期收獲種子;C.除草劑抗性篩選:將收獲的T0代種子進(jìn)行除草劑抗性篩選;D.抗性植株P(guān)CR分子檢測(cè)。
　　2.利用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),對(duì)影響農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效率的主要因素進(jìn)行優(yōu)化,同時(shí)分析這些因素對(duì)轉(zhuǎn)化后的玉米爛穗率以及結(jié)實(shí)率的影響,最終確定了玉米原位轉(zhuǎn)化體系的最佳轉(zhuǎn)化參數(shù)。結(jié)果表明,SilwetL-77是影響轉(zhuǎn)化效果最關(guān)鍵的因素,高濃度的Sil

3、wetL-77會(huì)降低結(jié)實(shí)率;其次是菌液濃度,且菌液濃度對(duì)玉米的爛穗率、結(jié)實(shí)率影響較大;高濃度的蔗糖會(huì)增加爛穗率。在菌液濃度為OD600=0.9,蔗糖濃度=30g/L,轉(zhuǎn)化介質(zhì)中加入0.03(v/v)濃度的SilwetL-77時(shí),PCR陽(yáng)性率最高達(dá)到2.38％。
　　3.應(yīng)用GUS基因瞬時(shí)表達(dá)技術(shù)對(duì)玉米原位轉(zhuǎn)化中農(nóng)桿菌侵染途徑及位置進(jìn)行組織化學(xué)分析,結(jié)果顯示:GUS基因表達(dá)最早見(jiàn)于子房組織,隨著侵染時(shí)間的持續(xù),連接子房與花序軸的小穗