羅漢果遺傳轉化體系的建立與CS基因的轉化研究.pdf

1、羅漢果（Siraitia grosvenorii）為我國特有的藥用和甜料經濟作物，其果實中的有效成分甜苷Ⅴ(MogrosidesⅤ)是世界上甜度最高的非糖甜味物質之一。葫蘆二烯醇酶(Cucurbitadienol Synthase，CS)是甜苷Ⅴ生物合成的關鍵酶，利用基因工程技術，構建CS基因過表達載體，通過根癌農桿菌的介導將其轉入羅漢果中，將是提高甜苷Ⅴ含量的一種途徑。羅漢果雌、雄異株，后代群體中雌株比例小，因而大量雄株浪費土地和資金

2、;且種質資源匱乏，傳統(tǒng)雜交育種困難。本文研究以羅漢果雌株組培苗真葉為外植體，優(yōu)化了葉片離體再生體系;以正交試驗設計為方法，通過根癌農桿菌的介導將CS基因過表達載體轉入羅漢果中，建立了羅漢果遺傳轉化體系，為羅漢果轉基因育種提供了科學依據。研究結果如下:
　　1、羅漢果無菌苗壯苗的最佳激素組合為0.3 mg/L的6-BA和0.05 mg/L的IBA，株高達7.67 cm，新增葉片數(shù)為4.90張/株，最大葉面積達8.00 cm2。

3、>　　2、葉片誘導的最佳激素組合為0.7 mg/L的TDZ和0.2 mg/L的IBA，出愈時間為12.7天，出愈率達89.43％，誘導出的愈傷組織大小為0.73cm。
　　3、愈傷組織誘導芽分化的最佳6-BA濃度為0.5mg/L，分化率達73.33％，平均芽數(shù)4.11個/塊;
　　4、遺傳轉化中最佳的Km篩選濃度為10 mg/L;
　　5、葉片遺傳轉化的最佳Cef抑菌濃度為300 mg/L;
　　6、愈傷組織遺傳

4、轉化的最佳Cef抑菌濃度為600 mg/L;
　　7、葉片遺傳轉化研究中，正交試驗結果的最優(yōu)組合為(A2B2C1D3)，即葉片最佳預培養(yǎng)時間為1天，最適農桿菌菌液濃度為OD600=0.5，最適侵染時間為5 min，最佳共培養(yǎng)時間為3天。用延遲篩選的方式篩選抗性再生苗，經PCR鑒定抗性苗224株，獲得了3株轉CS基因過表達載體的陽性植株，總轉化率為1.34％;
　　8、愈傷組織遺傳轉化中未檢測到陽性植株。但根據除轉化率外的其他