以潮霉素為篩選標(biāo)記的水稻葉綠體轉(zhuǎn)化體系的建立.pdf

1、在植物細(xì)胞中，DNA遺傳物質(zhì)不僅存在于細(xì)胞核內(nèi)，也存在于葉綠體中。傳統(tǒng)的細(xì)胞核遺傳工程存在諸如基因沉默、失活、位置效應(yīng)、多基因同時轉(zhuǎn)化困難、花粉漂移等弊端，而作為新型轉(zhuǎn)基因途徑的葉綠體轉(zhuǎn)化技術(shù)可有效克服常規(guī)核轉(zhuǎn)化中的諸多不足。利用同源重組機制，葉綠體轉(zhuǎn)化技術(shù)可將外源基因定點整合到葉綠體基因組中，有效地避免位置效應(yīng)等基因沉默難題。葉綠體基因組自身的原核結(jié)構(gòu)、高拷貝數(shù)和母系遺傳等特點，為外源基因獲得高效表達(dá)提供了平臺，而且外源基因不會隨花粉

2、擴散造成環(huán)境污染。目前，雙子葉植物尤其是煙草的葉綠體轉(zhuǎn)化技術(shù)已經(jīng)非常成熟，并且在生物反應(yīng)器方面具有重要的應(yīng)用價值。但在單子葉植物水稻中，該技術(shù)尚未得到有效應(yīng)用。
　　水稻（Oryza sativa L.）作為全球最重要的谷物之一，與人類的生活密不可分。葉綠體轉(zhuǎn)化技術(shù)這一新興的育種手段在水稻中的建立，將為實現(xiàn)農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提供幫助。本文開展了水稻的葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化研究，嘗試建立水稻葉綠體轉(zhuǎn)化的標(biāo)準(zhǔn)程序，主要內(nèi)容如下:
　　1.

3、利用6種常用的基因工程試劑測試水稻愈傷組織的敏感性，確定了以潮霉素、氯霉素和草丁膦為篩選壓力，其抗性基因hpt、CAT和bar基因為選擇標(biāo)記基因，來構(gòu)建水稻葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。
　　2.以水稻9311葉綠體基因組序列trnI-trnA為同源重組序列，煙草葉綠體調(diào)控元件5'16SrRNA為啟動子，煙草葉綠體3'psbA為終止子，以增強型綠色熒光蛋白基因（EGFP）為報告基因，構(gòu)建水稻葉綠體熒光表達(dá)載體。其中，在EGFP基因的上游5'

4、端設(shè)置了一系列不同的Leader序列（其mRNA可與核糖體結(jié)合）。在大腸桿菌原核系統(tǒng)中，分析了這一系列不同的Leader調(diào)控序列對EGFP基因表達(dá)的影響。結(jié)果表明，Prrn啟動子需在Leader序列的輔助下才能使EGFP基因得到表達(dá)，而單獨的Prrn啟動子不能啟動EGFP基因的表達(dá)。通過測量大腸桿菌的熒光值，發(fā)現(xiàn)Prrn啟動子在T7g10 Leader序列配合下獲得的熒光值最高。熒光強弱順序為:Prrn+T7g10 Leader＞Prr

5、n+rbcL Leader＞Prrn+atpB Leader＞Prrn+psbA Leader＞Prrn+RBS＞Prrn。
　　選擇在大腸桿菌中熒光表達(dá)最強的水稻葉綠體熒光載體pUIPEBA7(trnI-Prrn-T7g101-EGFP-TpsbA-trnA)，對洋蔥表皮細(xì)胞和杜氏鹽藻細(xì)胞進(jìn)行基因槍轟擊，報告基因EGFP在洋蔥表皮細(xì)胞和杜氏鹽藻葉綠體中得到瞬時表達(dá)，證實了該載體上的調(diào)控元件和基因槍轉(zhuǎn)化方法的適用性。
　　3

6、.在水稻葉綠體熒光載體pUIPEBA7的基礎(chǔ)上，分別加入了hpt基因、CAT基因、bar基因3個標(biāo)記基因，分別得到3個水稻葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化載體pCTE04，pCTE05和pCTE06，并對4個水稻品種的幼胚和愈傷分別進(jìn)行基因槍轟擊。對T0代轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行分子檢測，PCR和Southern blot結(jié)果證實pCTE04載體上的hpt和EGFP基因成功整合到水稻TP309葉綠體基因組的trnI-trnA位點。對T1代轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行RT-PCR檢測

7、，表明hpt和EGFP基因在葉綠體中得到轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)，共聚焦熒光掃描顯微鏡檢測到EGFP基因在葉綠體中表達(dá)出綠色熒光。上述結(jié)果表明，以潮霉素作為篩選壓力建立了水稻葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。
　　4.盡管hpt和EGFP外源基因在葉綠體中得到表達(dá)，但是未能獲得同質(zhì)化植株，而且水稻的葉綠體轉(zhuǎn)化效率很低。針對這一問題，我們在水稻核轉(zhuǎn)化中，加入Co60γ射線輻照處理，探討輻射對基因槍轉(zhuǎn)化效率的影響。結(jié)果表明轟擊后的愈傷經(jīng)過適宜劑量的γ輻射處