基于Col-I-PVA共聚紡絲技術(shù)構(gòu)建支架型ACL.pdf

1、前交叉韌帶(anterior cruciate ligament，ACL)是保持膝關(guān)節(jié)穩(wěn)定的一條重要關(guān)節(jié)內(nèi)韌帶，它阻止脛骨前移，對(duì)膝關(guān)節(jié)的運(yùn)動(dòng)和穩(wěn)定影響巨大。然而ACL損傷后幾乎不能自行修復(fù)，這對(duì)關(guān)節(jié)穩(wěn)定影響是巨大的，其后果包括傷后立即導(dǎo)致關(guān)節(jié)的不穩(wěn)定及遠(yuǎn)期膝關(guān)節(jié)退變，從而嚴(yán)重影響膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)，導(dǎo)致殘障。尤其在骨性關(guān)節(jié)炎病人中，韌帶損傷已經(jīng)被證實(shí)是重要的早期誘因之一。現(xiàn)有的治療主要為手術(shù)置換重建ACL，然而現(xiàn)有治療方法均存在一定的缺陷

2、。自體組織移植常常導(dǎo)致供區(qū)部位的并發(fā)癥，且需要二次手術(shù)；異體組織移植存在傳染疾病的風(fēng)險(xiǎn)，且存在免疫排斥問(wèn)題。人工前交叉韌帶重建ACL是近年來(lái)逐漸興起的一種治療方法，該手段無(wú)來(lái)源限制，無(wú)傳染疾病風(fēng)險(xiǎn)。然而，現(xiàn)在臨床上可用的商品化人工韌帶多為永久性韌帶，存在疲勞斷裂的可能。由聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯(polyethylene terephthalate，PET)纖維制作的先進(jìn)性韌帶加強(qiáng)系統(tǒng)(ligament advanced reinforce

3、ment system，LARS)在近年的臨床應(yīng)用中顯示了令人滿意的結(jié)果，但LARS仍存在一些不足，例如缺乏長(zhǎng)期隨訪研究等。組織工程技術(shù)的發(fā)展，為ACL的重建修復(fù)治療提供了新的思路和技術(shù)。
　　 目前，國(guó)內(nèi)外有眾多學(xué)者從事人工韌帶/組織工程韌帶研究，并且已有多種高分子材料制作的組織工程韌帶在實(shí)驗(yàn)室研究中顯示出良好的生物相容性和物理性能。但仍存在一些問(wèn)題，以致目前無(wú)修復(fù)重建效果好的人工前交叉韌帶以及真正的組織工程韌帶應(yīng)用于臨床治療

4、?，F(xiàn)較為熱門的組織工程韌帶材料有：1、天然高分子材料如膠原、蠶絲等；2、人工合成高分子材料如聚乙醇酸(Polyglycolicacido，PGA)、聚乳酸(polylactic，PLA)、聚乙烯醇(polyvinyl alcohol，PVA)等。這些高分子材料在實(shí)驗(yàn)室研究中均取得了一些較為滿意的結(jié)果，但仍與臨床應(yīng)用的要求存在一定差距。究其原因主要有：1、材料的生物活性欠佳；2、材料的生物相容性欠佳；3、新生組織與原組織接合欠佳；4、材料

5、的降解速度與組織再生速度不匹配；5、材料的力學(xué)性能有待提高等。
　　 綜上所述，本研究依照材料仿生學(xué)原理，應(yīng)用天然ACL細(xì)胞外基質(zhì)主要成分Ⅰ型膠原蛋白(CollagenⅠ，Col-Ⅰ)與聚乙烯醇(PVA)共聚后采用濕法紡絲技術(shù)制成纖維，構(gòu)建支架型人工前交叉韌帶。結(jié)合臨床使用實(shí)際，本研究在不進(jìn)行細(xì)胞體外種植的條件下進(jìn)行了人工前交叉韌帶置換重建。研究中發(fā)現(xiàn)，Col-Ⅰ/PVA共聚纖維的力學(xué)性能滿意，與PET纖維在最大載荷方面無(wú)顯著性

6、差異，彈性模量?jī)?yōu)于PET纖維；Col-Ⅰ/PVA共聚纖維的體外降解試驗(yàn)顯示其降解速度可滿足新生組織的生長(zhǎng)替代速度。Col-Ⅰ/PVA共聚纖維浸提液MTT比色法、直接接觸L-929細(xì)胞共培養(yǎng)及小鼠皮下植入短期(9W)實(shí)驗(yàn)，顯示Col-Ⅰ/PVA共聚纖維具有良好的生物相容性；在大動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，Col-Ⅰ/PVA共聚纖維構(gòu)建的韌帶可以起到早期功能重建的作用，在對(duì)新生組織進(jìn)行組織學(xué)染色分析后顯示新生組織、細(xì)胞形態(tài)與正常ACL組織、細(xì)胞類似；免疫組

7、化染色示新生韌帶Ⅰ型膠原蛋白呈陽(yáng)性，Ⅲ型膠原蛋白呈弱陽(yáng)性，tenascin-c呈陽(yáng)性，提示新生組織為韌帶組織；力學(xué)性能檢測(cè)示新生韌帶其最大載荷為472.43±15.20N，雖與正常ACL630.07±76.11N的最大載荷相比較具有差異，但已可以負(fù)荷日常的膝關(guān)節(jié)活動(dòng)。
　　 第一部分Col-Ⅰ/PVA共聚纖維的制備與體外降解、
　　 力學(xué)性能，生物相容性檢測(cè)
　　 本部分研究為了更好的修復(fù)重建ACL，依據(jù)材料仿生

8、原理，采用Col-Ⅰ與PVA常溫共聚濕法紡絲技術(shù)，制成Col-Ⅰ/PVA共聚纖維；對(duì)Col-Ⅰ/PVA共聚纖維的體外降解、力學(xué)性能進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。采用Col-Ⅰ/PVA浸提液MTT比色法，Col-Ⅰ/PVA共聚纖維與L-929細(xì)胞直接接觸共培養(yǎng)法，皮下組織短期植入(9W)，對(duì)Col-Ⅰ/PVA共聚纖維進(jìn)行生物相容性檢測(cè)。
　　 一、實(shí)驗(yàn)方法
　　 1.25℃條件下，按照50:50的濃度配制成Col-Ⅰ/PVA共聚紡絲原液，

9、經(jīng)過(guò)濾、脫泡后采用濕法制絲，以飽和硫酸鈉溶液為凝固劑的凝固浴中在適當(dāng)?shù)臓恳饔孟轮瞥蒀ol-Ⅰ/PVA共聚纖維。(Col-Ⅰ/PVA共聚纖維由四川樂(lè)山五通橋豐茂精細(xì)化工有限公司提供制作)
　　 2.Col-Ⅰ/PVA共聚纖維相關(guān)理化性能檢測(cè)
　　 (1)體外降解實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)Col-Ⅰ/PVA共聚纖維降解速度；
　　 (2)Col-Ⅰ/PVA共聚纖維為實(shí)驗(yàn)組與PET纖維為對(duì)照組，進(jìn)行相關(guān)力學(xué)測(cè)試；
　　 3.分

10、為100%濃度Col-Ⅰ/PVA共聚纖維浸提液、50%濃度Col-Ⅰ/PVA共聚纖維浸提液、空白對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照4個(gè)組，使用小鼠成纖維細(xì)胞(L-929)，MTT比色法測(cè)定各組細(xì)胞在1、2、3、4、5、6、7d的吸光度值，計(jì)算細(xì)胞相對(duì)增殖率(relative growth rate，RGR)，判定細(xì)胞毒性的級(jí)別；
　　 4.Col-Ⅰ/PVA共聚纖維與L-929細(xì)胞直接接觸共培養(yǎng)，倒置顯微鏡和掃描電鏡觀察細(xì)胞在Col-Ⅰ/PVA共聚

11、纖維上的生長(zhǎng)、增殖情況；
　　 5.將Col-Ⅰ/PVA共聚纖維和聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯(PET)纖維分別植入昆明小鼠背部皮下，術(shù)后第1周、第3周、第9周分別取標(biāo)本大體觀察，HE、Masson三色法進(jìn)行組織學(xué)對(duì)比觀察。
　　 二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　 1.通過(guò)濕法紡絲技術(shù)制成的Col-Ⅰ/PVA共聚纖維為60但尼爾(Denier，D)，纖維質(zhì)地柔軟，具有可編織性。
　　 2.通過(guò)體外降解實(shí)驗(yàn)，顯示Col-Ⅰ/PV

12、A共聚纖維降解率為1W：8.28%，2W：15.14%，3W：16.26%，4W：16.88%，6W：17.17%，8W：17.44%。
　　 3.經(jīng)力學(xué)測(cè)試，Col-Ⅰ/PVA共聚纖維束：最大載荷：88.6433±0.69189N，抗拉強(qiáng)度：112.8667±0.88288Mpa，彈性模量：0.4667±0.04631Gpa，斷裂伸長(zhǎng)率：17.2733±1.41608%，斷裂強(qiáng)度：56.51±13.54123Mpa；PET纖維

13、束：最大載荷：96.1075±0.9393N，抗拉強(qiáng)度：151.07±1.47561Mpa，彈性模量：123.48±14.76304Gpa，組斷裂伸長(zhǎng)率：21.32±7.68921%，斷裂強(qiáng)度：39.2125±5.18963Mpa。Col-1/PVA共聚纖維組與PET組在拉伸試驗(yàn)中除彈性模量p<0.05具有顯著性差異外，其余的各項(xiàng)參數(shù)p>0.05，無(wú)顯著性差異。
　　 4.MTT比色法：2個(gè)實(shí)驗(yàn)組(50%、100%浸提液組)細(xì)胞

14、在不同時(shí)間點(diǎn)的相對(duì)增殖率為90%～123.61%，Col-Ⅰ/PVA共聚纖維的細(xì)胞毒性評(píng)級(jí)為0～1級(jí)；
　　 5.直接接觸共培養(yǎng)法：細(xì)胞與Col-Ⅰ/PVA共聚纖維直接接觸共培養(yǎng)4d，生長(zhǎng)良好、形態(tài)呈梭型，較多細(xì)胞附著材料生長(zhǎng)。
　　 6.皮下植入的Col-Ⅰ/PVA共聚纖維和PET纖維在術(shù)后第1周、第3周、第9周均有包膜形成，隨植入時(shí)間的延長(zhǎng)，材料周圍包膜透明度逐漸增高，包膜周圍炎細(xì)胞主要為中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)

15、胞，隨時(shí)間的延長(zhǎng)炎細(xì)胞數(shù)量明顯減少。
　　 三、結(jié)論
　　 Col-Ⅰ/PVA共聚纖維質(zhì)地柔軟，具有可編織性，降解速度及力學(xué)性能較好，符合支架型人工前交叉韌帶的要求。Col-Ⅰ/PVA共聚纖維的生物相容性良好，細(xì)胞毒性為0～1級(jí)，組織相容性良好，在臨床應(yīng)用的允許范圍內(nèi)。
　　 第二部分支架型人工ACL制備，大動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及新生韌帶檢測(cè)
　　 為了更好了解Col-Ⅰ/PVA共聚纖維構(gòu)建的支架型人工前交叉韌帶的修

16、復(fù)重建性能，本部分研究采用中國(guó)廣西巴馬小型豬，進(jìn)行人工前交叉韌帶置換重建，并對(duì)重建后的ACL大體解剖及主要細(xì)胞外基質(zhì)的相對(duì)含量進(jìn)行檢測(cè)。
　　 一、實(shí)驗(yàn)方法
　　 1.支架型Col-Ⅰ/PVA共聚纖維前交叉韌帶的編織構(gòu)建
　　 2.支架型Col-Ⅰ/PVA共聚纖維前交叉韌帶的拉伸測(cè)試
　　 3.大動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
　　 4.術(shù)后評(píng)價(jià)
　　 二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　 1.重建韌帶的最大載荷及彈性模

17、量與Col-Ⅰ/PVA共聚纖維前交叉韌帶無(wú)顯著性差異，與廣西巴馬小型豬天然ACL較為接近。
　　 2.影像學(xué)觀察：DR檢查示人工前交叉韌帶固定牢靠，螺釘位置好；CT薄層掃描示實(shí)驗(yàn)組骨隧道沒(méi)有擴(kuò)大并已有較為明顯的鈣化組織形成；MRI示人工前交叉韌帶上已形成新生組織，影像學(xué)觀察與正常PCL較為類似。
　　 3.大體觀察：大體觀察實(shí)驗(yàn)組ACL重建后未發(fā)現(xiàn)明顯關(guān)節(jié)腔內(nèi)積液及滑膜組織增生；固定用螺釘在位牢靠；在原ACL部位形成新生

18、韌帶組織，其形態(tài)、色澤基本同正常ACL(圖3-20A)?？瞻讓?duì)照組單純切除ACL后未發(fā)現(xiàn)明顯關(guān)節(jié)腔內(nèi)積液、滑膜組織增生，ACL切除后無(wú)修復(fù)，原ACL附麗部被滑膜組織包裹。
　　 4.組織學(xué)染色、免疫組化染色分析：組織學(xué)分析后顯示新生組織、細(xì)胞形態(tài)與正常ACL組織相類似；免疫組化染色示重建韌帶Ⅰ膠原蛋白及tenascin-c呈陽(yáng)性，Ⅲ型膠原蛋白呈弱陽(yáng)性，提示新生組織為韌帶組織。
　　 5.超微結(jié)構(gòu)觀察：掃描電鏡觀察見，大量

19、纖維樣新生組織生長(zhǎng)并緊密附著于未降解的Col-Ⅰ/PVA共聚纖維；有大量卷曲樣膠原纖維形成。
　　 三、結(jié)論
　　 通過(guò)支架型人工前交叉韌帶修復(fù)重建ACL的大動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，術(shù)后24周觀察、檢測(cè)示：人工前交叉韌帶可起到早期功能重建作用，重建的新生韌帶中纖維細(xì)胞及ECM與正常ACL相類似，力學(xué)性能也與ACL相近。研究顯示Col-Ⅰ與PVA共聚纖維支架型人工前交叉韌帶具有良好的應(yīng)用前景。
　　 全文結(jié)論
　　 本研

20、究中Col-Ⅰ/PVA共聚纖維構(gòu)建的支架型人工前交叉韌帶，在材料上具有較高的仿生性，兩種材料的共聚彌補(bǔ)了Col-Ⅰ和PVA在力學(xué)性能及降解速度等方面各自的不足。Col-Ⅰ/PVA共聚纖維的力學(xué)性能滿意，與PET纖維在最大載荷等方面上無(wú)顯著性差異；Col-Ⅰ/PVA共聚纖維的體外降解試驗(yàn)顯示其降解速度可滿足新生組織的生長(zhǎng)替代速度；通過(guò)細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)及組織相容性實(shí)驗(yàn)，顯示Col-Ⅰ/PVA共聚纖維具有良好的生物相容性。通過(guò)大動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，Col-