新型醫(yī)用可吸收鎂合金JDBM的生物毒性、髓內(nèi)降解及細(xì)菌學(xué)相關(guān)研究.pdf

1、第一部分:新型醫(yī)用可吸收鎂合金JDBM的生物毒性
　　目的：交大鎂合金系列（Jiao Da bio-magnesium series, JDBM）是上海交通大學(xué)輕合金精密成型國(guó)家工程研究中心設(shè)計(jì)開發(fā)的生物相容性好、強(qiáng)度和塑韌性相匹配、腐蝕行為近乎均勻的新型高性能生物醫(yī)用Mg-Nd-Zn-Zr(平衡-3-0.2-0.4 wt.%)基合金系列，分為2類，JDBM1具有高強(qiáng)度和中等塑性，應(yīng)用于骨科；JDBM2具有高塑性和中等強(qiáng)度，應(yīng)用于

2、血管支架。該合金體系添加了少量細(xì)胞毒性輕微的輕稀土元素Nd作為低合金化元素，Nd的加入可以保證鎂合金具有良好的時(shí)效析出強(qiáng)化和固溶強(qiáng)化效果，并可大幅度提高合金基體的電極電位，減小基體與第二相的電偶腐蝕電位差，從而提高鎂合金的耐均勻腐蝕性能。Zn是人體生理需要的微量元素，微量加入可提高合金強(qiáng)度及塑性加工能力；微量Zr作為晶粒細(xì)化劑可提高合金的強(qiáng)韌性和耐蝕性，其在鎂合金中的生物相容性已經(jīng)證實(shí)。JDBM的強(qiáng)度、柔韌性、耐蝕性能和生物相容性全面超

3、越已經(jīng)在歐洲進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)的WE43鎂合金。相比于商業(yè)性的WE43和AZ31鎂合金，JDBM具有更好的生物相容性。JDBM在體內(nèi)90天時(shí)基本完好，在180天時(shí)降解少于40%。本實(shí)驗(yàn)的目的，即通過研究含輕稀土Nd元素的JDBM鎂合金及單純的Nd對(duì)體外培養(yǎng)的小鼠胚胎成骨細(xì)胞株MC3T3-E1的毒性，分析JDBM鎂合金中稀土元素Nd的體外成骨細(xì)胞毒性，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)部分通過研究Nd對(duì)昆明小鼠骨及周圍組織的生理病理影響，以及其在小鼠各器官組織中的分布，

4、來研究Nd的生物安全性及其動(dòng)物體內(nèi)分布情況。
　　方法：按標(biāo)準(zhǔn)方法用aMEM培養(yǎng)基制作Nd的浸提液，并稀釋為1/2、1/4、1/8幾個(gè)不同的濃度梯度，同時(shí)制作Ti合金、WE43鎂合金、JDBM鎂合金及CaP涂層JDBM鎂合金的浸提液，以正常培養(yǎng)組做空白對(duì)照，以Ti合金浸提液組做陰性對(duì)照，以0.64%苯酚組做陽(yáng)性對(duì)照，用含10%澳洲胎牛血清的aMEM培養(yǎng)基對(duì)MC3T3-E1成骨細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，觀察其不同時(shí)間的形態(tài)變化及增殖情況，并以C

5、CK8法檢測(cè)其不同時(shí)間的細(xì)胞增殖活性，以Annexin V PI雙染色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同時(shí)間的細(xì)胞凋亡情況。將梯度量的Nd微粒加入正常培養(yǎng)的成骨細(xì)胞培養(yǎng)液中，最低量接近JDBM植入物釋放的Nd量，觀察微粒入胞情況，并制作細(xì)胞爬片，用電子目鏡接普通顯微鏡直接動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞吞噬Nd微粒的情況，然后行HE染色觀察細(xì)胞形態(tài)變化。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)部分，將不同量的Nd微粒置于小鼠股骨旁組織，檢測(cè)1、3、5天小鼠的血液電解質(zhì)、肝腎功能變化、Nd在小鼠體內(nèi)的分布

6、及局部病理切片觀察Nd微粒引起的病理變化。
　　結(jié)果：用CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性，Nd浸提液原液組細(xì)胞毒性較大，與苯酚陽(yáng)性對(duì)照組實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，其與正常對(duì)照組、Ti合金浸提液組、JDBM浸提液組、WE43浸提液組、Nd浸提液1/4、1/8濃度組相比P<0.00001，而后幾者之間無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Nd浸提液原液及苯酚組與Nd浸提液稀釋至1/2組之間P<0.01，有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。從流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果得知，隨Nd浸提液濃度及作用時(shí)間

7、的增加，成骨細(xì)胞凋亡明顯增多。微粒入胞實(shí)驗(yàn)動(dòng)態(tài)及靜態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，成骨細(xì)胞通過主動(dòng)胞吞作用吞噬周圍環(huán)境中的Nd微粒，微粒較少時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)無明顯影響，微粒量多時(shí)則可導(dǎo)致成骨細(xì)胞膜破裂，直至細(xì)胞崩解死亡。通過計(jì)算比較，JDBM及WE43中Nd2.5%左右的含量可能會(huì)導(dǎo)致周圍細(xì)胞的損傷。將不同量的Nd微粒置于小鼠股骨旁組織，小鼠的血液電解質(zhì)及肝腎功能較正常組無明顯變化。小鼠體內(nèi)各組織器官的Nd元素分布因無合適的檢測(cè)合作單位而待測(cè)，病理組織切片顯示大

8、量的Nd微粒對(duì)周圍組織細(xì)胞有一定的損傷。
　　結(jié)論：Nd浸提液的成骨細(xì)胞毒性及對(duì)成骨細(xì)胞凋亡的影響隨濃度的減小而減小，JDBM中微量Nd對(duì)成骨細(xì)胞無明顯毒性；成骨細(xì)胞通過主動(dòng)胞吞作用攝取周圍環(huán)境中的Nd微粒，當(dāng)微粒數(shù)量達(dá)到一定程度時(shí)，成骨細(xì)胞崩解，JDBM中微量Nd顆粒對(duì)成骨細(xì)胞的增殖及形態(tài)無明顯不良影響。相對(duì)于Nd微粒的細(xì)胞損傷，JDBM和WE43中的Nd含量可能過高。Nd微粒對(duì)小鼠的肝腎功能、電解質(zhì)無明顯影響，多量的Nd微粒對(duì)

9、周圍組織細(xì)胞有一定的損傷。
　　第二部分:新型醫(yī)用可吸收鎂合金JDBM的髓內(nèi)降解及病理生理效應(yīng)
　　目的：生物體內(nèi)可降解吸收材料是生物材料發(fā)展的重要方向，由于金屬材料具有較好的強(qiáng)度和塑韌性，因此金屬基可降解吸收材料具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。鎂是所有金屬材料中生物力學(xué)性能與人體骨最接近的金屬材料，具有理想的生物力學(xué)相容性，因此，鎂合金作為可降解生物材料具有巨大的應(yīng)用潛力。目前臨床應(yīng)用的生物體內(nèi)可降解吸收材料主要是聚合物和某些陶瓷

10、材料，如聚乳酸、磷酸鈣等。但由于聚合物材料強(qiáng)度偏低、陶瓷材料的塑韌性較差限制了其廣泛使用。近年來，以生物可降解鎂合金(biodegradablemagnesium alloys)為主要代表的具有生物可降解(吸收)特性的新一代醫(yī)用金屬材料的研究受到了人們的特別關(guān)注。鎂合金因具有與人體骨頭接近的密度和彈性模量、高比強(qiáng)度和比剛度、生物可降解性以及生物相容性等優(yōu)點(diǎn)，近10年來國(guó)內(nèi)外研究人員對(duì)其應(yīng)用于骨內(nèi)植物、骨組織工程支架和心血管支架等領(lǐng)域進(jìn)行

11、了廣泛的研究。然而，目前大多數(shù)研究均以現(xiàn)有商用鎂合金為對(duì)象，如含Al元素的AZ31、AZ91以及含重稀土元素的WE43等，并未考慮到作為生物材料的安全性等問題。上海交通大學(xué)輕合金精密成型國(guó)家工程研究中心，作為我國(guó)重要的鎂合金材料及精密成型工藝研究的國(guó)家級(jí)研究基地，近年來在可降解醫(yī)用鎂合金材料研究領(lǐng)域也取得了令國(guó)際同行矚目的研究成果。該研究中心研究人員與醫(yī)學(xué)研究人員合作，積極開展生物醫(yī)用鎂合金材料的臨床應(yīng)用基礎(chǔ)研究。上海交通大學(xué)研究人員運(yùn)

12、用第一性原理計(jì)算與分子動(dòng)力學(xué)模擬方法，并與實(shí)驗(yàn)相結(jié)合，從原子、分子水平深入系統(tǒng)地探索了鎂的變形機(jī)制，定量評(píng)估了所優(yōu)選的生物相容性好的合金元素對(duì)鎂中層錯(cuò)能及位錯(cuò)滑移、孿生等變形傾向的影響，設(shè)計(jì)開發(fā)了生物相容性好、強(qiáng)度和塑韌性相匹配、腐蝕行為接近均勻腐蝕的新型高性能生物醫(yī)用鎂合金Mg-Nd-Zn-Zr基合金系列(Jiao Dabio-magnesium series，簡(jiǎn)稱JDBM)，已經(jīng)分別申請(qǐng)中國(guó)和國(guó)際專利保護(hù)。該合金體系中通過加入少量細(xì)

13、胞毒性輕微(臨床可接受)的輕稀土元素Nd作為低合金化元素，Nd的加入可以保證鎂合金具有良好的時(shí)效析出強(qiáng)化和固溶強(qiáng)化效果，并可大幅度提高鎂合金基體的電極電位，減小基體與第二相的電偶腐蝕電位差，從而提高鎂合金的耐均勻腐蝕性能。JDBM可降解鎂合金自研制成功以來，一直在進(jìn)行各項(xiàng)臨床前實(shí)驗(yàn)研究，以了解其各項(xiàng)生物學(xué)性能，以便進(jìn)一步改進(jìn)其各項(xiàng)性能并爭(zhēng)取早日應(yīng)用于臨床醫(yī)療實(shí)踐中。我們已經(jīng)做了一些JDBM鎂合金釘板系統(tǒng)方面的研究，取得了許多重要的第一手

14、資料，但尚未進(jìn)行JDBM鎂合金髓內(nèi)針方面的實(shí)驗(yàn)研究。本實(shí)驗(yàn)的目的在于檢測(cè)可降解JDBM鎂合金髓內(nèi)針對(duì)大鼠股骨代謝的影響及其病理生理變化，并檢測(cè)JDBM鎂合金髓內(nèi)針在大鼠股骨髓腔內(nèi)的降解行為，通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究對(duì)本材料的醫(yī)用價(jià)值做出一定程度的評(píng)估。
　　方法：將JDBM鎂合金及對(duì)照的Ti合金、WE43鎂合金、CaP涂層JDBM做成1 mm x30 mm的髓內(nèi)針，消毒后進(jìn)行無菌手術(shù)將其植入雄性SD大鼠左側(cè)股骨髓腔內(nèi)，每組6只。在1、3個(gè)

15、月進(jìn)行99mTc-MDP骨三相掃描及SPECT-CT檢查，通過骨顯像核素掃描了解大鼠股骨植入JDBM鎂合金髓內(nèi)針后的代謝狀況，比較與對(duì)照側(cè)及對(duì)照組的差異。1、3個(gè)月拍攝X線片了解髓內(nèi)針的位置與降解的大體情況。在15天，1、3、6個(gè)月檢測(cè)大鼠的血生化電解質(zhì)變化。3、6個(gè)月做骨組織病理硬切片，通過骨硬組織切片觀察大鼠股骨的病理變化，并檢測(cè)不同時(shí)間髓內(nèi)針的降解情況，確定其降解速率。
　　結(jié)果：JDBM髓內(nèi)針組大鼠股骨的放射性標(biāo)記物攝取率

16、明顯高于對(duì)側(cè)股骨及Ti合金對(duì)照組，P<0.01，與WE43組及CaP涂層JDBM組相比無明顯差異。骨三相掃描顯示鎂合金髓內(nèi)針植入側(cè)血供旺盛。血電解質(zhì)檢測(cè)各組未見明顯差異。大鼠股骨X線片攝片顯示，1、3月時(shí)JDBM髓內(nèi)針形態(tài)完好，密度均勻，但6、8月時(shí)影像略顯模糊，X線透光程度不等，CaP涂層JDBM髓內(nèi)針及WE43髓內(nèi)針也出現(xiàn)程度不等的類似變化，可能系鎂合金刺激周圍骨組織增生所致。大鼠骨硬組織病理切片顯示，JDBM髓內(nèi)針在大鼠髓腔內(nèi)緩慢

17、降解，并促進(jìn)骨組織增生，未見明顯畸形細(xì)胞。與Ti合金組相比，JDBM及CaP涂層JDBM組、WE43組髓內(nèi)針周圍成骨明顯。1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月的時(shí)間內(nèi)，JDBM髓內(nèi)針在大鼠骨髓腔內(nèi)緩慢降解，至6個(gè)月時(shí)降解不超過20%，直徑由最初的1 mm至大于0.8 mm，質(zhì)量減少不超過20%，而CaP涂層JDBM組降解更為緩慢，WE43組降解略快于JDBM組，Ti合金組無降解。
　　結(jié)論： JDBM對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物大鼠的血清肝腎功能、電解質(zhì)無明顯影

18、響。JDBM在大鼠髓腔內(nèi)4個(gè)月時(shí)降解比較輕微，刺激周圍骨組織增生的作用已經(jīng)顯現(xiàn)，6個(gè)月時(shí)周圍骨組織明顯增生，相應(yīng)的JDBM髓內(nèi)針影像略顯模糊，應(yīng)力遮擋效應(yīng)減弱。JDBM等鎂合金髓內(nèi)針可導(dǎo)致大鼠局部核素?cái)z取增多，表明局部代謝旺盛，鎂合金有促進(jìn)大鼠髓腔內(nèi)代謝的作用。JDBM髓內(nèi)針可促進(jìn)骨代謝及骨形成，有利于損傷骨組織的修復(fù)。JDBM鎂合金髓內(nèi)針在骨髓腔內(nèi)逐漸降解，后期降解趨于緩慢。JDBM及CaP涂層JDBM、WE43髓內(nèi)針植入大鼠股骨后，

19、其髓腔內(nèi)組織皆未發(fā)現(xiàn)明顯的不良反應(yīng)。
　　第三部分:新型醫(yī)用可吸收鎂合金JDBM與葡萄球菌粘附及生物膜模型
　　目的：骨科假體植入后葡萄球菌感染是世界范圍內(nèi)比較棘手的問題，醫(yī)療實(shí)踐中通過應(yīng)用各種材料改性技術(shù)和研發(fā)新材料等方法以期減少感染的發(fā)生。關(guān)節(jié)假體感染（prosthetic joint infection， PJI）和無菌性松動(dòng)是人工關(guān)節(jié)置換術(shù)后的重要并發(fā)癥。在美國(guó)，PJI是導(dǎo)致人工全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)失敗的首要原因，也是人工