葉酸對神經(jīng)干細胞Notch和MAPK信號通路相關(guān)基因及蛋白表達作用的研究.pdf

1、目的:研究葉酸對大鼠胎鼠、新生鼠神經(jīng)干細胞(neuralstemcells，NSCs)增殖分化中Notch和MAPK信號通路相關(guān)基因及蛋白表達作用的機制。 方法:采用孕14-16dSD胎鼠及24h內(nèi)同窩新生鼠全腦，進行NSCs原代培養(yǎng)。在正常培養(yǎng)條件下，分為4組：①對照組；②葉酸缺乏組，添加甲氨蝶呤為0.4μg/ml；③葉酸低劑量組，添加葉酸為4μg/ml；④葉酸高劑量組，添加葉酸為40μg/ml。在加入MAPK通路抑制劑U01

2、26的條件下，分為4組：①對照組：②U0126組，只添加U0126為10μM；③U0126+低劑量葉酸組，添加U0126為10μM同時添加葉酸為4μg/ml；@U0126+高劑量葉酸組，添加U0126為10μM同時添加葉酸為40μg/ml。增殖第6d收集一半細胞，另一半加入含血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)6d，誘導(dǎo)細胞分化，第13d收集分化的細胞。葉酸、甲氨蝶呤等試劑均用培養(yǎng)液配制。首先按正常條件培養(yǎng)神經(jīng)干細胞，每次換液加入葉酸時即加入10μM的U

3、0126。采用克隆、酶切與測序等方法對RT-PCR產(chǎn)物進行鑒定；采用實時定量SYBRCreenI-PCR方法，測定NSCsMAPK信號通路相關(guān)基因(ERK1、ERK2)mRNA表達情況；采用WesternBlot方法，正常培養(yǎng)條件下Notch信號通路相關(guān)蛋白(Notch1、HES5、Neurogeninl)的表達情況和加入MAPK通路抑制劑U0126條件下，該通路中相關(guān)蛋白(pERK1、pERK2)的表達情況。 結(jié)果:1、普通R

4、T-PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)克隆、酶切、測序顯示，特異性好，擴增片段與預(yù)期結(jié)果相符。 2、SYBRCreenI-PCR結(jié)果顯示，在加入MAPK通路抑制劑U0126的條件下，葉酸對胎鼠增殖期NSCsERK1/2mRNA表達的影響各組之間無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)；葉酸對新生鼠增殖期NSCsERK1/2mRNA表達的影響，某些組間雖有統(tǒng)計學(xué)差異，但沒有一定的規(guī)律，體現(xiàn)不出葉酸的作用。 3、WesternBlot方法對J下常培養(yǎng)條件

5、下Notch信號通路和加入MAPK通路抑制劑U0126條件下該通路中相關(guān)蛋白進行了檢測，結(jié)果顯示：(1)Notch通路增殖補充葉酸能夠促進NSCsNotch1、HES5蛋白的表達(P<0.05)，分化晚期補充葉酸能夠降低Neurogenin1蛋白的表達(P<0.05)，同時也能增加HES5蛋白的表達(P<0.05)。(2)MAPK通路無論增殖期分化期，葉酸對胎鼠及新生鼠NSCspERK1、pERK2蛋白表達的影響均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.

6、05)。 結(jié)論:1、在正常培養(yǎng)條件下，葉酸可能通過上調(diào)增殖期胎鼠、新生鼠NSCsNotch信號通路中Notch1、HES5蛋白的表達促進神經(jīng)干細胞的增殖；而在NSCs的分化晚期，葉酸再一次上調(diào)HES5蛋白的表達，下調(diào)Neurogenin1蛋白的表達，促進NSCs向星形膠質(zhì)細胞分化。 2、在加入MAPK通路抑制劑U0126條件下，葉酸對增殖期胎鼠、新生鼠NSCsERK1/2mRNA的表達影響不明顯：對增殖分化期胎鼠、新生鼠

7、NSCspERK1、pERK2蛋白的表達影響也不明顯。 3、在正常培養(yǎng)條件下，葉酸40μg/ml劑量組與4μg/ml劑量對胎鼠、新生鼠NSCs的增殖分化中Notch通路中相關(guān)蛋白的調(diào)節(jié)作用基本一致；同樣，在加入MAPK通路抑制劑U0126條件下，這兩個劑量組對胎鼠、新生鼠NSCs的增殖分化MAPK通路中相關(guān)蛋白表達的調(diào)節(jié)作用也基本一致。 因此，葉酸可能通過影響Notch和MAPK信號通路中相關(guān)基因及蛋白的表達從而促進NS