MCMV感染對神經(jīng)干細(xì)胞Wnt信號通路下游分化相關(guān)靶基因蛋白表達(dá)的影響.pdf

1、目的:
　　 研究MCMV對神經(jīng)干細(xì)胞Wnt信號通路下游分化相關(guān)靶基因c-myc、cyclinD1、ngn-1、ngn-2蛋白表達(dá)的影響，以探討CMV致胎腦發(fā)育異常的分子機(jī)制。
　　 方法:
　　 1)小鼠神經(jīng)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)：剖宮取出孕13.5d的BALB/c胎鼠腦組織，制備單細(xì)胞懸液，過濾后用含EGF、bFGF和B27的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)；取第4～5代細(xì)胞，用添加2[％]胎牛血清的DMEM/F12分

2、化培養(yǎng)基(不含EGF、bFGF和B27)誘導(dǎo)NSCs分化，以模擬胎腦發(fā)育過程。
　　 2)MCMV感染NSCs分化培養(yǎng)細(xì)胞模型：用感染復(fù)數(shù)(MOI)分別為5、1和0.1的MCMV毒株感染NSCs，改用分化培養(yǎng)基進(jìn)行分化培養(yǎng)，正常NSCs同期分化培養(yǎng)作為對照。
　　 3)MCMV感染對NSCs Wnt信號途徑分化相關(guān)基因蛋白表達(dá)的影響：采用Western Blot法檢測分化培養(yǎng)后0.5d、1d、2d、3d、4d和5d時(shí)

3、NSCs Wnt信號途徑下游分化相關(guān)靶基因c-myc、cyclinD1、ngn-1、ngn-2蛋白表達(dá)水平的動(dòng)態(tài)變化，各實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
　　 結(jié)果:
　　 1)體外成功分離培養(yǎng)NSCs，NSCs在體外可連續(xù)傳代，呈球形生長，并可進(jìn)一步分化。
　　 2)MCMV感染NSCs后，鏡下可觀察到細(xì)胞貼壁障礙，細(xì)胞腫脹甚至崩解壞死。
　　 3)Western Blot檢測結(jié)果：
　　 a.感染組c-

4、myc蛋白表達(dá)量比正常對照組明顯下降，除MOI=0.1組的0.5d和5d時(shí)間點(diǎn)外，其余各感染量與各時(shí)間點(diǎn)c-myc蛋白表達(dá)均顯著低于正常對照組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量(P﹤0.05)；
　　 b.感染組cyclinD1蛋白表達(dá)量表現(xiàn)為在感染后0.5d和1d，各MOI感染組表達(dá)水平均明顯低于正常對照組(P﹤0.05)；在感染后2d和3d，MOI=5組明顯高于其他三組(P﹤0.05)，MOI=1組明顯高于正常對照組(P﹤0.05)；在感染

5、后4d和5d，MOI=5組明顯低于其他三組(P﹤0.05)；
　　 c.感染組ngn-1蛋白表達(dá)量比正常對照組明顯下降，當(dāng)MOI=0.1時(shí)，ngn-1蛋白表達(dá)量在感染后1d、2d明顯低于正常對照組(P＜0.05)，而MOI=1組和MOI=5組表達(dá)量在感染后1d、2d、3d、4d、5d均明顯低于正常對照組(P＜0.05)；
　　 d.感染組ngn-2蛋白表達(dá)先降后升，與正常組先升后降相反，MOI=0.1和1組峰值后移至

6、感染后5d，且明顯低于正常對照組峰值(P＜0.05)。各感染組ngn-2表達(dá)量在感染后1d明顯低于正常對照組(P＜0.05)；感染后2d，MOI=5組明顯低于正常對照組(P＜0.05)；在感染后3d、4d、5d，各組ngn-2表達(dá)量又明顯高于正常對照組(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1)MCMV抑制分化培養(yǎng)的NSCs細(xì)胞c-myc和ngn-1蛋白表達(dá)，并誘導(dǎo)cyclinD1和ngn-2蛋白表達(dá)紊亂，其效應(yīng)隨感染