DCF1基因表達(dá)下調(diào)對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞分化的影響.pdf

1、神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells，NSCs)可自我復(fù)制并具有多向分化潛能，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷及退行性疾病的治療中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。將神經(jīng)干細(xì)胞移植到受損部位，可分化成機(jī)體的特定神經(jīng)細(xì)胞，完成特定的神經(jīng)功能。然而神經(jīng)干細(xì)胞移植存在諸多技術(shù)上的難題，其中移植后神經(jīng)干細(xì)胞分化并參與神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)重建的能力成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)。闡明神經(jīng)干細(xì)胞的分化機(jī)制對(duì)于解決以上問(wèn)題有重要理論意義和實(shí)用價(jià)值。 在神經(jīng)干細(xì)胞中，樹(shù)突細(xì)胞因子(de

2、ntritic cell factor 1,DCF1)基因的功能未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)DCF1基因在未分化的神經(jīng)干細(xì)胞中高表達(dá)而在終末分化的神經(jīng)細(xì)胞中表達(dá)量很低，由此推測(cè)此基因可能與神經(jīng)干細(xì)胞的分化有關(guān)；隨后克隆并在小鼠神經(jīng)干細(xì)胞中過(guò)量表達(dá)此基因，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，過(guò)量表達(dá)DCF1基因的細(xì)胞軸突生長(zhǎng)被抑制，DCF1基因可維持神經(jīng)干細(xì)胞的狀態(tài)。為了進(jìn)一步研究DCF1基因在神經(jīng)干細(xì)胞分化中的作用，本研究構(gòu)建了RNAi載體，分析DCF

3、1基因被抑制后細(xì)胞的分化情況。此外，用轉(zhuǎn)錄因子圈套的方法探索了此基因啟動(dòng)子區(qū)的功能區(qū)域。本實(shí)驗(yàn)主要進(jìn)行了以下三部分的研究： 1.研究了以電穿孔法和脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染神經(jīng)干細(xì)胞系C17.2的影響因素，獲得了轉(zhuǎn)染的優(yōu)化參數(shù)。結(jié)果顯示，在C17.2細(xì)胞中，脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染效率優(yōu)于電穿孔法。在24孔板中1.5μgDNA和1μl Lipofectamin2000的組合可得到70％以上轉(zhuǎn)染率。 2.構(gòu)建了四個(gè)RNAi載體以及一個(gè)序列打亂的對(duì)照

4、載體。在轉(zhuǎn)錄后水平上抑制DCF1基因的表達(dá)。結(jié)果顯示當(dāng)DCF1基因抑制后，神經(jīng)干細(xì)胞分化神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞，免疫組化證實(shí)主要向膠質(zhì)細(xì)胞分化，差異顯著(p＜0.01)。首次證實(shí)了DCF1基因?qū)ι窠?jīng)干細(xì)胞分化的抑制作用，已申請(qǐng)發(fā)明專(zhuān)利，申請(qǐng)?zhí)枺?00610026207.1。 3.用轉(zhuǎn)錄因子圈套的方法，在轉(zhuǎn)錄水平抑制了DCF1基因表達(dá)。在基因的啟動(dòng)子不同區(qū)域設(shè)計(jì)了三個(gè)高親和力的寡核苷酸(oligodeoxynucleotid，ODNs)