INK4a-ARF基因共轉(zhuǎn)染對肺腺癌A549細(xì)胞生物學(xué)行為及藥物敏感性的影響.pdf

1、本研究定位于人類染色體9p21的INK4a/ARF基因位點，所編碼的兩個蛋白質(zhì)p16INK4a和p14ARF分別在目前所發(fā)現(xiàn)的兩條關(guān)鍵細(xì)胞周期調(diào)控通路-pRb通路和p53通路中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。本研究通過陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，將這兩個周期調(diào)控基因同時導(dǎo)入INK4a/ARF基因位點缺失的人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549中，恢復(fù)蛋白p16INK4a和p14ARF在該細(xì)胞系中的表達(dá)，研究其對A549細(xì)胞生物學(xué)行為的影響和轉(zhuǎn)染前后對5種常用肺腺癌化療藥物

2、敏感性的影響。 方法1.利用陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，將含有人全長野生型INK4a/ARF基因的真核表達(dá)重組質(zhì)粒pcDNA3-p16INK4a和pcDNA3-p14ARF導(dǎo)入該基因位點缺失的人肺腺癌A549細(xì)胞系中，并確定所編碼的兩種蛋白p16INK4a和p14ARF同時在A549細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)。 2.經(jīng)G418篩選，并利用RT-PCR、免疫細(xì)胞化學(xué)和Westernblotting檢測p16INK4a和p14ARF

3、蛋白的表達(dá)，篩選出同時表達(dá)p16INK4a和p14ARF蛋白的細(xì)胞株并命名為A549-p16INK4ap14ARF，空白對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后命名為A549-vector。 3.在設(shè)立空白組和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的情況下，利用細(xì)胞記數(shù)、克隆形成實驗、流式細(xì)胞技術(shù)進(jìn)行了轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞增殖曲線、克隆形成率、周期分布、凋亡指數(shù)等指標(biāo)的檢測和分析。 4.選擇5種不同作用機(jī)制的常用肺腺癌化療藥物鹽酸阿霉素(ADM)、順鉑(CDDP)、拓樸替康(TP

4、T)、紫杉醇(Taxol)、諾維本(NVB)，作用于轉(zhuǎn)染前后的細(xì)胞，利用MTT法，測定各種不同藥物的50％抑制濃度(IC50)，并測定在IC50藥物濃度作用下轉(zhuǎn)染細(xì)胞的凋亡指數(shù)，研究轉(zhuǎn)染對A549細(xì)胞化療敏感性的影響。 結(jié)果1.INK4a/ARF基因轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞應(yīng)用RT-PCR、免疫細(xì)胞化學(xué)和Westernblotting檢測，提示有目的蛋白表達(dá)，說明轉(zhuǎn)染成功。 2.轉(zhuǎn)染INK4a/ARF基因后的細(xì)胞與未轉(zhuǎn)染及空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

5、的細(xì)胞相比：其增殖速度明顯變緩，克隆形成率略有減少，轉(zhuǎn)染細(xì)胞G0/G1期的比例增加，同時S期和G2/M期的比例下降，轉(zhuǎn)染后的A549細(xì)胞G0/G1期的比例為59.5％，而未轉(zhuǎn)染及空轉(zhuǎn)染組細(xì)胞分別為51.2％和50.3％，轉(zhuǎn)染組與其它組相比差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義，p值分別為0.043和0.025，此外，轉(zhuǎn)染組AI也明顯增加，為8.0％，未轉(zhuǎn)染及空轉(zhuǎn)染組細(xì)胞均低于2.7％，轉(zhuǎn)染組與其它組相比差異非常顯著(p=0.000014)。 3

6、.轉(zhuǎn)染INK4a/ARF基因后，A549細(xì)胞對阿霉素和順鉑的IC50值顯著降低，阿霉素IC50從1.04±0.03μg/ml降到了0.43±0.02μg/ml，順鉑IC50從1.03±0.03μg/ml降到了0.54±0.02μg/ml，而拓樸替康、諾維本和紫杉醇的IC50值變化無顯著差異；此外，在IC50濃度作用下阿霉素和順鉑誘導(dǎo)的AI明顯高于其它三種藥物，阿霉素和順鉑分別為17.5％和14.3％，而另三者均低于7.6％，前兩者與后三

7、者差異非常顯著(p＜0.001)。 結(jié)論1.利用陽離子脂質(zhì)體DOTAP介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染技術(shù)可以有效的將pcDNA3-p16INK4a和pcDNA3-p14ARF質(zhì)粒同時轉(zhuǎn)染到肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549中并得到穩(wěn)定表達(dá)蛋白p16INK4a和p14ARF的細(xì)胞株A549-p16INK4a-p14ARF，表明利用陽離子脂質(zhì)體同時將兩個真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到真核細(xì)胞是可行的。 2.恢復(fù)腫瘤抑制基因p16INK4a和p14ARF在A549細(xì)胞