GRIM-19對肺腺癌耐藥細(xì)胞株A549-DDP藥物敏感性及相關(guān)基因表達(dá)的影響.pdf

1、研究背景:
　　肺癌目前已成為人類因癌癥死亡的主要原因之一?；熢诜伟┑闹委熤邪l(fā)揮著重要作用?；熕幬锏亩嗨幠退幨菍?dǎo)致化療失敗的主要原因,抗腫瘤藥物的藥理目的是使活性藥物到達(dá)腫瘤細(xì)胞的靶位點,發(fā)揮細(xì)胞毒作用,導(dǎo)致細(xì)胞死亡。阻斷這一過程的任一位點,均可使藥物失去作用而產(chǎn)生耐藥。P糖蛋白(P-gp)是一種ATP依賴性的跨膜外流泵,通過將細(xì)胞內(nèi)化療藥物排出細(xì)胞,使腫瘤細(xì)胞內(nèi)化療藥物的蓄積濃度降低而導(dǎo)致耐藥。幾乎所有人類腫瘤細(xì)胞均有不同程

2、度的P-gp表達(dá),對化療不敏感或療效差的腫瘤細(xì)胞往往有較高的P-gp表達(dá)水平。干擾素/維甲酸誘導(dǎo)凋亡相關(guān)基因-19(gene associated with retinoid-IFN-induced mortality-19,GRIM-19),是一種應(yīng)用反義基因敲除的方法分離發(fā)現(xiàn)的調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡因子。GRIM-19在多數(shù)腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)受抑制,實驗證明在腎細(xì)胞腫瘤細(xì)胞系中,GRIM-19表達(dá)明顯下調(diào),其下調(diào)可以通過增強(qiáng)依賴STAT3(si

3、gnal transducers and activators of transcription3)基因的表達(dá)而促進(jìn)腫瘤生長,因此認(rèn)為GRIM-19具有腫瘤抑制因子作用。STAT3在多種惡性腫瘤中呈過度激活及表達(dá)狀態(tài),乳腺癌及宮頸癌細(xì)胞的相關(guān)研究表明STAT3可以調(diào)節(jié)P-gp的表達(dá),增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是腫瘤血管生成關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子,能促進(jìn)新生血管生成。耐藥肺腺癌細(xì)胞中GRIM-19的表達(dá)情況及其與

4、STAT3、VEGF、P-gp的相互關(guān)系國內(nèi)外尚未有報道。
　　目的:
　　檢測GRIM-19在非小細(xì)胞肺癌耐藥細(xì)胞株A549/DDP中的表達(dá)情況,將GRIM-19轉(zhuǎn)染到A549/DDP中,觀察轉(zhuǎn)染GRIM-19后肺腺癌耐藥細(xì)胞株A549/DDP對化療藥物敏感性的改變,同時研究GRIM-19與STAT3、P-gp、VEGF的相互關(guān)系,探討GRIM-19對肺腺癌耐藥細(xì)胞株A549/DDP化療敏感性及相關(guān)基因STAT3、VEGF

5、、P-gp表達(dá)的影響。
　　方法:
　　1、四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測A549與A549/DDP對多種化療藥物敏感性差異
　　將A549和A549/DDP細(xì)胞分別種植于4個96孔培養(yǎng)板,待細(xì)胞貼壁后分別加入不同濃度順鉑(DDP)、絲裂霉素(MMC)、足葉乙苷(VP-16)、長春新堿(VCR),于48h后向培養(yǎng)板內(nèi)加入MTT,半小時后加入DMSO,檢測其吸光度,分別根據(jù)吸光度計算IC50值,計算耐藥倍數(shù)(resist

6、ance index,RI)=耐藥株IC50值/敏感株IC50值。
　　2、實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Q-PCR)方法檢測GRIM-19 mRNA、STAT3 mRNA、VEGF mRNA、P-gp mRNA在A549、A549/DDP中的表達(dá)
　　分別抽取100mm培養(yǎng)皿A549和A549/DDP細(xì)胞的總RNA,然后采用Q-PCR法分別檢測GRIM-19 mRNA、Stat3 mRNA、P-gp mRNA、VEGF mR

7、NA表達(dá)的變化。
　　3、蛋白免疫印跡(Western-blot)法檢測A549、A549/DDP中GRIM–19蛋白的表達(dá)
　　分別抽取100mm培養(yǎng)皿A549和A549/DDP細(xì)胞的總蛋白,然后采用Western Blot法分別檢測GRIM-19蛋白表達(dá)的變化。
　　4、pIRES-Puro2-GRIM-19-Myc表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行測序
　　表達(dá)質(zhì)粒pIRES-Puro2-GRIM-19-Myc測序觀察其是否有基

8、因突變。
　　5、將PIRES-GRIM-19-MYC和PIRES-MYC質(zhì)粒采用脂質(zhì)體法分別轉(zhuǎn)染順鉑耐藥株A549/DDP。
　　分別用 Lipofectamine2000將 pIRES-Puro2-GRIM-19-Myc和pIRES-Puro2-Myc轉(zhuǎn)染A549/DDP,用G418(濃度0.60μg/mL)持續(xù)篩選4周建立穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株:A549/DDP-GRIM-19(AD/G)和A549/DDP-CON(AD/C)。<

9、br>　　6、MTT法檢測A549/DDP-GRIM-19與A549/DDP-CON對多種化療藥物敏感性差異
　　將A549/DDP-GRIM-19與A549/DDP-CON細(xì)胞分別種植于96孔培養(yǎng)板,待細(xì)胞貼壁后分別加入不同濃度DDP、MMC、VP-16、VCR,于48h后向培養(yǎng)板內(nèi)加入MTT,半小時后加入DMSO,檢測其吸光度,分別根據(jù)吸光度計算IC50值,計算逆轉(zhuǎn)倍數(shù)(reversal factor, RF)=對照組IC50

10、/實驗組IC50。
　　7、Q-PCR方法檢測GRIM-19 mRNA、STAT3 mRNA、VEGF mRNA、P-gp mRNA在A549/DDP-GRIM19及A549/DDP-CON中的表達(dá)
　　分別抽取100mm培養(yǎng)皿A549/DDP-GRIM19及A549/DDP-CON細(xì)胞的總RNA,然后采用 Q-PCR法分別檢測GRIM-19 mRNA、Stat3 mRNA、P-gp mRNA、VEGF mRNA表達(dá)的變化。

11、
　　8、Western-blot法檢測A549/DDP-GRIM-19及A549/DDP-CON中GRIM–19蛋白的表達(dá)
　　分別抽取100mm培養(yǎng)皿A549/DDP-GRIM-19及A549/DDP-CON細(xì)胞的總蛋白,然后采用Western Blot法分別檢測GRIM-19蛋白表達(dá)的變化。
　　9、統(tǒng)計方法
　　實驗數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析,計量數(shù)據(jù)用x±SE表示,兩組間均數(shù)比較采用t檢驗

12、,多組間均數(shù)比較用單因素方差分析,并經(jīng)LSD檢驗;蛋白質(zhì)印跡法檢測各條帶灰度值通過專業(yè)圖像分析軟件Image-Pro Plus進(jìn)行分析;以P值<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1、A549與A549/DDP對多種化療藥物敏感性差異
　　MTT結(jié)果顯示順鉑耐藥株 A549/DDP較 A549對 DDP的耐藥倍數(shù)為16.86±1.32倍,對MMC、VP-16、VCR耐藥倍數(shù)分別為7.22±0.73、10.17

13、±0.53、9.17±0.72(p<0.05)。
　　2、GRIM-19 mRNA、STAT3 mRNA、VEGF mRNA、P-gp mRNA在A549和A549/DDP中的表達(dá)
　　Q-PCR結(jié)果表明:與敏感株A549相比,耐藥株A549/DDP的GRIM-19 mRNA表達(dá)低于對應(yīng)的A549,STAT3、VEGF、P-gp mRNA在A549/DDP中的表達(dá)均高于A549(p<0.05)。
　　3、A549與A5

14、49/DDP中GRIM–19蛋白的表達(dá)
　　Western Blot法表明:與敏感株A549相比,耐藥株A549/DDP的GRIM-19蛋白表達(dá)低于對應(yīng)的A549(p<0.05)。
　　4、成功建立穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株:A549/DDP-GRIM-19(AD/G)和A549/DDP-CON(AD/C)并實現(xiàn)體外持續(xù)傳代培養(yǎng)
　　5、A549/DDP轉(zhuǎn)染GRIM-19后對多種化療藥物敏感性的逆轉(zhuǎn)作用
　　MTT結(jié)果顯示A54

15、9/DDP轉(zhuǎn)染GRIM-19后較轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組耐藥性降低,對DDP耐藥逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為3.70±0.91倍,對 MMC、VP-16、VCR耐藥逆轉(zhuǎn)倍數(shù)分別為1.74±0.70、1.31±0.34、1.62±0.28(p<0.05)。
　　6、GRIM-19 mRNA、STAT3 mRNA、VEGF mRNA、P-gp mRNA在 A549/DDP-GRIM-19及A549/DDP-CON中的表達(dá)
　　Q-PCR結(jié)果提示穩(wěn)定轉(zhuǎn)染GRI

16、M-19后,A549/DDP/GRIM-19的GRIM-19mRNA表達(dá)明顯高于A549/DDP-CON,而STAT3 mRNA、VEGF mRNA、P-gp mRNA表達(dá)與之相反(p<0.05)。
　　7、A549/DDP-GRIM19及A549/DDP-CON中GRIM-19蛋白的表達(dá)
　　Western Blot結(jié)果表明:與A549/DDP-CON相比,穩(wěn)轉(zhuǎn)株A549/DDP-GRIM-19的GRIM-19蛋白表達(dá)高于

17、對應(yīng)的穩(wěn)轉(zhuǎn)空質(zhì)粒組(p<0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.肺腺癌耐藥細(xì)胞株A549/DDP的GRIM-19 mRNA及蛋白表達(dá)水平均低于其相對應(yīng)的敏感株A549中的表達(dá),并且基因表達(dá)水平的降低伴隨有蛋白表達(dá)的相應(yīng)下降;
　　2.肺腺癌耐藥細(xì)胞株A549/DDP的STAT3 mRNA及P-gp mRNA、VEGF mRNA表達(dá)水平均高于敏感株A549中的表達(dá)。并且在肺腺癌耐藥細(xì)胞中也存在STAT3高表達(dá)與GRIM-19低