干擾eIF4E基因?qū)θ幦橄侔┘?xì)胞生物學(xué)行為與化療敏感性的影響.pdf

1、目的：三陰乳腺癌是一種特殊類(lèi)型的乳腺癌，與非三陰乳腺癌相比預(yù)后差，對(duì)內(nèi)分泌治療反應(yīng)不佳，臨床無(wú)有效靶向治療藥物。目前針對(duì)三陰乳腺癌的靶向藥物臨床研究較少，療效及安全性尚不確定，因此，尋找新的靶點(diǎn)，開(kāi)發(fā)新的更為安全有效的分子靶點(diǎn)藥物，將為治療三陰乳腺癌帶來(lái)光明的前景。真核起始因子4E(eIF4E)是真核細(xì)胞翻譯起始因子，在蛋白質(zhì)的翻譯起始階段起重要作用，并且與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、浸潤(rùn)密切相關(guān)。已有研究表明eIF4E在乳腺癌包括三陰乳

2、腺癌中高表達(dá)，與其預(yù)后有顯著相關(guān)性，并與乳腺癌的化療或放療的敏感性顯著相關(guān)，從而可能成為乳腺癌靶向治療的新靶點(diǎn)。目前，eIF4E基因?qū)θ幦橄侔┘?xì)胞生物行為影響的研究尚缺乏，本研究旨在闡明下調(diào)eIF4E基因表達(dá)后三陰乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的改變，包括細(xì)胞周期的影響、細(xì)胞侵襲遷移的影響、化療藥物敏感性的影響及可能機(jī)制等，為其作為三陰乳腺癌治療的新靶點(diǎn)提供理論基礎(chǔ)。
　　 方法：構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)shRNA-eIF4E載體及siRNA-eI

3、F4E瞬時(shí)轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞(三陰乳腺癌細(xì)胞)，通過(guò)Western blotting法檢測(cè)eIF4E蛋白表達(dá)，評(píng)價(jià)干擾效率，選擇最有效的干擾轉(zhuǎn)染細(xì)胞株進(jìn)行試驗(yàn)?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)觀察瞬時(shí)干擾前后三陰乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖能力、侵襲轉(zhuǎn)移能力變化；流式細(xì)胞術(shù)觀察細(xì)胞周期變化；MTT法觀察干擾前后細(xì)胞對(duì)化療藥物(順鉑、阿霉素、紫杉醇、多西他賽)敏感性變化；Western blotting法檢測(cè)干擾前后M

4、DA-MB-231細(xì)胞中Bax、Bcl-2、p53和p21蛋白表達(dá)的變化。
　　 結(jié)果：成功構(gòu)建并篩選了穩(wěn)定表達(dá)shRNA-eIF4E的三陰乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染siRNA-eIF4E三陰乳腺癌MDA-MB-231和MDA-MB-435細(xì)胞，兩種方法均可明顯抑制上述細(xì)胞中eIF4E蛋白的表達(dá)；克隆形成實(shí)驗(yàn)及流式細(xì)胞術(shù)表明：干擾eIF4E表達(dá)使MDA-MB-231細(xì)胞阻滯在G1期，細(xì)胞處于增生不活躍狀態(tài)，明顯抑制

5、細(xì)胞增殖；Transwell實(shí)驗(yàn)顯示：干擾eIF4E表達(dá)可能導(dǎo)致三陰乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力下降；MTT法表明：降低eIF4E表達(dá)可增強(qiáng)包括順鉑、紫杉醇、阿霉素、多西他賽等化療藥物對(duì)三陰乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的敏感性；Western blotting法顯示：干擾MDA-MB-231細(xì)胞中eIF4E表達(dá)誘導(dǎo)p53和p21的表達(dá)上調(diào)，同時(shí)明顯增加促凋亡蛋白Bax蛋白表達(dá)，而顯著減少抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白表達(dá)，即

6、凋亡相關(guān)蛋白Bax/Bcl-2比例明顯升高。
　　 結(jié)論：⑴成功構(gòu)建eIF4E靶向shRNA表達(dá)質(zhì)粒，應(yīng)用此質(zhì)粒轉(zhuǎn)染三陰乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞；瞬時(shí)eIF4E-RNAi轉(zhuǎn)染三陰乳腺癌MDA-MB-231及MDA-MB-435細(xì)胞；兩種方法均有效抑制eIF4E基因蛋白水平表達(dá)，為后續(xù)的研究提供了有力的工具。⑵干擾eIF4E基因表達(dá)使三陰乳腺癌細(xì)胞阻滯在G1期，細(xì)胞處于增生不活躍狀態(tài)，可顯著地抑制細(xì)胞增殖和細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力。