大鱗副泥鰍早期發(fā)育及耐氨機(jī)制研究.pdf

1、大鱗副泥鰍是東亞地區(qū)近幾年養(yǎng)殖需求非常高的水產(chǎn)養(yǎng)殖品種之一，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值都非?？捎^，市場(chǎng)潛力巨大。本文在借鑒前人的研究基礎(chǔ)上，對(duì)大鱗副泥鰍(Paramisgurnus dabryanus)早期發(fā)育階段的生長(zhǎng)模式、核酸含量變化、消化酶活性變化及骨骼畸形及其耐氨機(jī)制進(jìn)行了相關(guān)研究，主要研究結(jié)果如下:
　　(1)大鱗副泥鰍早期發(fā)育階段的生長(zhǎng)模式
　　以初孵至60日齡(DAH)大鱗副泥鰍仔魚作為實(shí)驗(yàn)材料，評(píng)價(jià)了大鱗副泥鰍早期

2、階段體重體長(zhǎng)關(guān)系以及身體各部分異速生長(zhǎng)模式。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大鱗副泥鰍仔魚階段最為適合的體重體長(zhǎng)關(guān)系為指數(shù)模型，BW=0.025× TL2.649(R2=0.996)。大鱗副泥鰍仔魚頭長(zhǎng)、頭高、軀干長(zhǎng)、尾長(zhǎng)及眼徑在早期階段均表現(xiàn)為正異速生長(zhǎng)，而體高、尾柄高、尾鰭長(zhǎng)、胸鰭長(zhǎng)及須長(zhǎng)在早期階段則表現(xiàn)為負(fù)異速生長(zhǎng)。隨后，大鱗副泥鰍仔魚身體各部分又表現(xiàn)出相似的異速生長(zhǎng)模式，均向著等速生長(zhǎng)逐漸變化。結(jié)果說明大鱗副泥鰍早期發(fā)育階段身體各部分異速生長(zhǎng)的發(fā)育順

3、序遵循對(duì)提高存活率的重要性。
　　(2)大鱗副泥鰍早期發(fā)育階段核酸及蛋白的變化
　　測(cè)定了大鱗副泥鰍從孵化至60 DAH期間核酸及蛋白質(zhì)含量以評(píng)價(jià)其早期階段的生長(zhǎng)。以紫外分分光光度法測(cè)定大鱗副泥鰍仔稚魚的核酸含量（n=3，養(yǎng)殖溫度24.4±0.4℃，溶解氧7.1±0.5 mg L-1，pH7.9±0.4）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)核糖核酸(RNA)含量在2-5 DAH期間顯著下降，在5-10 DAH之間快速上升，隨后持續(xù)降低，直至試驗(yàn)結(jié)束。

4、脫氧核糖核酸(DNA)含量也在2-5 DAH期間上升，在5-9 DAH期間下降，隨后表現(xiàn)為緩慢上升，直至26 DAH，隨后降低至一個(gè)相對(duì)較為穩(wěn)定的水平直至試驗(yàn)結(jié)束。RNA-DNA比和protein-DNA比均與生長(zhǎng)速率表現(xiàn)出明顯的相關(guān)性，大鱗副泥鰍早期發(fā)育階段RNA-DNA比與生長(zhǎng)速率之間表現(xiàn)為明顯的正相關(guān)關(guān)系。結(jié)果表明大鱗副泥鰍早期發(fā)育階段細(xì)胞水平上的生長(zhǎng)模式為從孵化到卵黃囊耗盡主要表現(xiàn)為細(xì)胞數(shù)量的增生，初次攝食之后則是細(xì)胞體積、質(zhì)量

5、的增大。此外，大鱗副泥鰍早期發(fā)育階段的關(guān)鍵期應(yīng)在17 DAH之前。
　　(3)大鱗副泥鰍早期發(fā)育階段消化酶活力的變化
　　研究了從孵化至40 DAH期間大鱗副泥鰍仔稚魚不同胰酶（胰蛋白酶，糜蛋白酶，淀粉酶及脂肪酶）、胃酶（胃蛋白酶）及腸酶（堿性磷酸酶及亮氨酸氨基肽酶）的比活力和總活力以評(píng)價(jià)其早期階段的消化生理。大鱗副泥鰍仔魚養(yǎng)殖溫度為24.4±0.4℃，在初次攝食(4 DAH)至15 DAH期間投喂輪蟲，10-35 DAH期

6、間投喂小型枝角類，30-40 DAH期間投喂人工配合飼料。胰蛋白酶、糜蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性在仔魚孵化當(dāng)天即可檢出，說明這些消化酶是受基因調(diào)控的。多數(shù)胰酶活性均在20 DAH之前增加，而在隨后開始降低。大鱗副泥鰍仔魚胃蛋白酶在30 DAH時(shí)開始檢出，表明了其消化系統(tǒng)中功能性胃腺的出現(xiàn)。堿性磷酸酶也在仔魚孵化時(shí)即可檢出，隨后快速上升，并在20 DAH時(shí)達(dá)到第二個(gè)峰值。而亮氨酸氨基肽酶活性在整個(gè)試驗(yàn)過程中均表現(xiàn)為逐漸上升的趨勢(shì)。因此，大

7、鱗副泥鰍仔魚在外源性營(yíng)養(yǎng)開始之前就有一個(gè)功能性的消化系統(tǒng)，而且其消化能力隨著個(gè)體發(fā)育而增加。腸酶活力在10-20 DAH之間的顯著增加意味著大鱗副泥鰍成魚消化模式的開端。30DAH之后胃蛋白酶活力的顯著上升，標(biāo)志著大鱗副泥鰍仔魚由堿性消化方式向酸性消化方式的轉(zhuǎn)變，而這一時(shí)期是大鱗副泥鰍仔魚轉(zhuǎn)食人工配合飼料的適當(dāng)時(shí)機(jī)。
　　(4)大鱗副泥鰍早期階段骨骼畸形的研究
　　采用硬骨-軟骨雙染色法研究了從孵化至60 DAH期間大鱗副泥

8、鰍仔稚魚骨骼畸形的發(fā)生。結(jié)果發(fā)現(xiàn)大鱗副泥鰍早期階段骨骼畸形發(fā)生的部位主要在脊椎骨的4個(gè)分區(qū)，以及背鰭、臀鰭和尾鰭，共觀察到14種骨骼畸形類型。大鱗副泥鰍仔稚魚不同時(shí)期骨骼畸形分布不同，本試驗(yàn)中未發(fā)現(xiàn)脊椎骨畸形，神經(jīng)棘畸形在階段A(TL＜12 mm)出現(xiàn)頻率最低，在階段D(TL＞50 mm)出現(xiàn)率最高;脈棘畸形在階段B(TL12-30 mm)出現(xiàn)頻率最低，在階段C(TL30-50 mm)出現(xiàn)頻率最高;鰭畸形在階段C(TL30-50 mm)

9、出現(xiàn)頻率最低，在階段B(TL12-30 mm)出現(xiàn)頻率最高。大鱗副泥鰍常見的畸形類型包括鰭條骨畸形、神經(jīng)棘及脈棘畸形等。仔稚魚骨骼畸形的高發(fā)可能與其機(jī)體的劇烈生理變化以及內(nèi)臟器官的增殖、分化相關(guān)。鰭條畸形、神經(jīng)棘分叉和脈棘融合出現(xiàn)的頻率最高，說明了這些組織最易受到環(huán)境變化的影響。直至試驗(yàn)結(jié)束仍未觀察到脊柱骨畸形，證明大鱗副泥鰍脊柱畸形的發(fā)生時(shí)期比較晚(60DAH之后)。
　　(5)空氣和氨氮暴露下大鱗副泥鰍體內(nèi)氨的累積
　　

10、將大鱗副泥鰍暴露于30 mmol L-1 NH4Cl溶液和空氣中，以研究其在氨氮和空氣暴露條件下體組織中氨、尿素含量以及谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶活性的變化。研究發(fā)現(xiàn)30 mmol L-1 NH4Cl溶液暴露下，隨著暴露時(shí)間的增加，大鱗副泥鰍血漿和腦組織中氨含量顯著增加;肝臟組織和肌肉組織中氨含量隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)在前24 h內(nèi)表現(xiàn)為少量的增加，而在暴露48 h后則顯著上升?？諝獗┞断?，隨著空氣暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，大鱗副泥鰍血漿、腦組織、肝臟組

11、織和肌肉組織中氨含量在前24 h內(nèi)表現(xiàn)為少量的增加，而在暴露48 h后則顯著上升，血漿、腦、肝臟和肌肉中氨含量分別上升為對(duì)照組的2.2倍、3.3倍、2.5倍和2.9倍。大鱗副泥鰍無論暴露于30 mmolL-1 NH4Cl溶液或者空氣中，不同暴露時(shí)間對(duì)其血漿、肝臟組織和肌肉組織中尿素含量的影響均非常的小，其體內(nèi)尿素含量在氨氮和空氣暴露下一直處于較為穩(wěn)定的水平，不受機(jī)體氨累積的影響。大鱗副泥鰍暴露于30 mmol L-1的NH4Cl溶液中，

12、暴露時(shí)間對(duì)其血漿中谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性的影響是很小的。而暴露于空氣中時(shí)，暴露時(shí)間顯著影響其血漿中谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性(P＜0.05），空氣暴露48 h后，其血漿中谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性顯著升高。然而，無論是暴露于30 mmol L-1的NH4Cl溶液中還是暴露于空氣中，大鱗副泥鰍血漿谷草轉(zhuǎn)氨酶活性及肝臟組織中谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶均不受暴露時(shí)間的影響。結(jié)果表明說明大鱗副泥鰍組織和細(xì)胞具有很高的氨耐受性，也可能具有以NH3形式揮發(fā)部分體內(nèi)氨以達(dá)到應(yīng)對(duì)氨氮毒性

13、的機(jī)制。大鱗副泥鰍無論暴露于30 mmol L-1 NH4Cl溶液或者空氣中，不同暴露時(shí)間對(duì)其血漿、肝臟組織和肌肉組織中尿素含量的影響均非常的小，說明大鱗副泥鰍并不是以合成尿素作為其主要的氨解毒策略。通過大鱗副泥鰍血漿中谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性的顯著升高，可推測(cè)其在空氣暴露下可能會(huì)通過部分氨基酸代謝生成丙氨酸以應(yīng)對(duì)體內(nèi)高濃度的氨累積。
　　(6)谷氨酰胺在大鱗副泥鰍應(yīng)對(duì)氨氮和空氣暴露中的作用
　　將大鱗副泥鰍暴露于30 mmol L-

14、1 NH4Cl溶液和空氣中，以研究其在氨氮和空氣暴露條件下體組織中谷氨酰胺含量以及谷氨酰胺合成酶和谷氨酸脫氫酶活力的變化。研究發(fā)現(xiàn)大鱗副泥鰍暴露于30 mmol L-1 NH4Cl溶液和空氣，隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，大鱗副泥鰍肝臟和肌肉組織中的谷氨酰胺含量有明顯累積的趨勢(shì)，腦、肝臟和腸道組織中谷氨酰胺合成酶活性均顯著上升，說明了大鱗副泥鰍可通過體組織中累積谷氨酰胺來應(yīng)對(duì)體內(nèi)氨濃度的上升，其可刺激體內(nèi)谷氨酰胺的合成，將氨轉(zhuǎn)化為無毒性的谷氨酰胺

15、。30 mmol L-1 NH4Cl溶液和空氣暴露顯著影響大鱗副泥鰍腦和腸道組織中谷氨酸脫氫酶活性，但對(duì)肝臟組織中谷氨酸脫氫酶活性并沒有顯著性影響。腸道中谷氨酸脫氫酶活性顯著上升，可能其在魚類應(yīng)對(duì)氨氮毒性中起到了比腸道谷氨酰胺合成酶更加重要的作用。而大鱗副泥鰍肝臟組織中谷氨酸脫氫酶活性并不受氨氮和空氣暴露的影響，這可能是由于肝臟組織中轉(zhuǎn)氨酶催化生成了足量的谷氨酸。
　　(7)氨氮和空氣暴露下大鱗副泥鰍體表堿化及氨氣揮發(fā)
　　

16、為確定大鱗副泥鰍是否具有以NH3形式排泄體內(nèi)氨的能力，設(shè)計(jì)了氨氮暴露和空氣暴露兩組試驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大鱗副泥鰍在NH4Cl溶液中暴露24 h后，試驗(yàn)組產(chǎn)生氨的量顯著高于對(duì)照組?？諝獗┞秾?dǎo)致大鱗副泥鰍NH3揮發(fā)量的顯著提高。試驗(yàn)結(jié)果說明大鱗副泥鰍在氨氮和空氣暴露下能夠以NH3形式排泄體內(nèi)過量的氨。大鱗副泥鰍NH3揮發(fā)量隨著暴露時(shí)間和溫度的增加而升高?？諝夂桶钡┞吨率勾篦[副泥鰍后腸壁明顯堿化，說明后腸是其揮發(fā)NH3的位點(diǎn)之一。皮膚在空氣暴露