兩種新型選擇復(fù)制性腺病毒M5,M6與復(fù)制缺陷型腺病毒Adv-TK的有效性以及安全性的系統(tǒng)比較.pdf

1、第一部分新型選擇復(fù)制性腺病毒M5以及M6的構(gòu)建及鑒定
　　 目的：構(gòu)建及鑒定兩種表達(dá)HSV-TK基因的新型選擇復(fù)制性腺病毒。
　　 方法：采用PCR的方法擴(kuò)增得到HSV-TK基因的全長，通過T4 連接酶將TK 全長連接到PcDNA3.1+/E3⊿6.7k/gp19k以及PcDNA3.1+/E3⊿ADP 上，然后采用同源重組法構(gòu)建M5以及M6。將得到的病毒感染293后提取HirtDNA，然后通過酶切以及PCR的方法鑒定M5

2、以及M6。
　　 結(jié)果：將通過PCR方法擴(kuò)增得到的全長送到測(cè)序公司測(cè)序后證明其序列是正確的，將以HirtDNA作為模板PCR擴(kuò)增后得到的產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，在1.2kb處有目的條帶存在，將用BanⅢ酶切過的HirtDNA凝膠電泳后在1.2kb 左右以及30kb以上可見目的條帶。
　　 結(jié)論：成功的構(gòu)建了表達(dá)HSV-TK基因的新型選擇復(fù)制性腺病毒M5以及M6。
　　 第二部分兩種新型選擇復(fù)制性腺病毒M5以及M6同Ad

3、v-TK體外效應(yīng)的對(duì)比
　　 目的：比較選擇復(fù)制性腺病毒M5以及M6與Adv-TK的體外效果。
　　 方法：Western blot 檢測(cè)M5，M6以及Adv-TK 感染腫瘤細(xì)胞以及正常細(xì)胞后細(xì)胞中TK 蛋白的表達(dá)量，結(jié)晶紫染色檢測(cè)M5，M6以及Adv-TK 對(duì)腫瘤細(xì)胞以及正常細(xì)胞的裂解作用，real-time PCR法檢測(cè)M5，M6以及Adv-TK在腫瘤細(xì)胞以及正常細(xì)胞中的復(fù)制能力，MTT 法以及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)并比較M

4、5，M6以及Adv-TK 對(duì)各種腫瘤細(xì)胞以及正常細(xì)胞的殺傷作用。
　　 結(jié)果：在腫瘤細(xì)胞中，M5以及M6的TK 蛋白表達(dá)量高于Adv-TK,其中M6的表達(dá)量在這三種病毒中最高，而在正常細(xì)胞中，Adv-TK的TK 蛋白表達(dá)量要明顯高于M5以及M6，而M6在正常細(xì)胞中幾乎不表達(dá)TK 蛋白；結(jié)晶紫染色顯示Adv-TK 對(duì)腫瘤細(xì)胞沒有裂解作用，在腺病毒感染第三天，M5對(duì)腫瘤細(xì)胞的裂解效應(yīng)要強(qiáng)于M6，但到感染第五天，M6 對(duì)腫瘤細(xì)胞的裂解

5、作用要強(qiáng)于M5，而即使以很高的MOI 感染正常細(xì)胞，M5以及M6 也不能裂解正常細(xì)胞；在腺病毒感染腫瘤細(xì)胞后36 小時(shí)內(nèi)，M5的復(fù)制量要大于M6，36h 之后，M6的復(fù)制量要大于M5，Adv-TK在腫瘤細(xì)胞中不復(fù)制，而在正常細(xì)胞中，M5，M6以及Adv-TK 均不復(fù)制；在以高濃度病毒感染腫瘤細(xì)胞時(shí)，M5，M6以及Adv-TK 對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效應(yīng)相似，但以低濃度病毒感染腫瘤細(xì)胞時(shí)，M5以及M6 對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效應(yīng)要明顯強(qiáng)于Adv-TK

6、，且M6的腫瘤殺傷效應(yīng)也強(qiáng)于M5，而當(dāng)M5，M6以及Adv-TK以500MOI 感染正常細(xì)胞時(shí)，M6對(duì)正常細(xì)胞幾乎無殺傷作用，而M5對(duì)正常細(xì)胞的殺傷作用也明顯小于Adv-TK。
　　 結(jié)論：在高M(jìn)OI 時(shí)，M5，M6以及Adv-TK 對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效應(yīng)相似；在低MOI 時(shí)，M5以及M6 對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力要明顯強(qiáng)于Adv-TK，且M6的腫瘤殺傷效應(yīng)也強(qiáng)于M5，但M5以及M6 對(duì)正常細(xì)胞的毒性明顯小于Adv-TK。
　　

7、 第三部分 M5，M6以及Adv-TK 對(duì)裸鼠原位瘤治療效應(yīng)的對(duì)比
　　 目的：比較選擇復(fù)制性腺病毒M5，M6與Adv-TK的體內(nèi)效應(yīng)。
　　 方法：構(gòu)建裸鼠胃癌原位模型，將Ad5/dE1A,M5和M6以及Adv-TK 注入裸鼠體內(nèi)，并連續(xù)14天注射更昔洛韋，每天60 mg/kg，比較M5，M6以及Adv-TK 對(duì)原位胃癌腫瘤的治療作用及對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移的影響，并比較對(duì)小鼠生存率的影響，HE 染色顯示對(duì)比腫瘤局部的組織結(jié)構(gòu)，

8、原位雜交檢測(cè)對(duì)比腺病毒在腫瘤局部的復(fù)制情況，免疫組化檢測(cè)對(duì)比存在于腫瘤局部的腺病毒的量，Weastern blot 法檢測(cè)腫瘤局部TK 蛋白的表達(dá)量。
　　 結(jié)果：M5和M6以及Adv-TK 均可抑制原位腫瘤的生長，但M5以及M6 對(duì)原位腫瘤的生長抑制作用明顯強(qiáng)于Adv-TK，而M6 對(duì)原位腫瘤的生長抑制作用要強(qiáng)于M5；M5以及M6 抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的能力也強(qiáng)于Adv-TK；相較于其他治療組，M6組的局部腫瘤組織中可檢測(cè)到更多病毒量

9、以及病毒復(fù)制，M5組局部腫瘤組織檢測(cè)到的病毒量也多于Adv-TK組；M5以及M6組中的TK 蛋白表達(dá)量也高于Adv-TK組；M5以及M6組小鼠生存率明顯高于Adv-TK組，且M6組小鼠生存率也高于M5組。
　　 結(jié)論：M5以及M6 對(duì)原位腫瘤的生長以及轉(zhuǎn)移的抑制作用明顯強(qiáng)于Adv-TK，且M5以及M6 對(duì)小鼠生存率的提高也明顯高于Adv-TK。
　　 第四部分 M5，M6以及Adv-TK在免疫全能小鼠腫瘤模型中的治療作用

10、以及代謝情況的對(duì)比
　　 目的：比較M5，M6以及Adv-TK 對(duì)免疫全能小鼠皮下瘤的治療作用，并對(duì)比這三種腺病毒在全能小鼠腫瘤模型中的代謝情況。
　　 方法：構(gòu)建C57BL/6 小鼠結(jié)腸癌皮下瘤模型，隨機(jī)分為5組，分別注射PBS，Ad5/dE1A，M5，M6以及Adv-TK，并每組連續(xù)注射更昔洛韋14天，每天60 mg/kg，觀察各組病毒對(duì)小鼠皮下瘤的生長抑制作用，每組分別在病毒注射后1d，4d，7d，14d以及28d

11、 處死5只小鼠，real-time PCR法檢測(cè)瘤體內(nèi)腺病毒的量以及TK表達(dá)量。
　　 結(jié)果：M5和M6以及Adv-TK 均可抑制免疫全能小鼠中皮下瘤的生長，但M5以及M6 對(duì)腫瘤的生長抑制作用明顯強(qiáng)于Adv-TK，且M6 對(duì)腫瘤的生長抑制作用要強(qiáng)于M5；M5以及M6在腫瘤局部存在的時(shí)間比Adv-TK 長，且病毒量在注射后第四天急劇減少，到注射后第7天，M5以及M6的病毒水平達(dá)到第二個(gè)高峰；M5以及M6組中腫瘤中TK的表達(dá)量高于

12、Adv-TK組，且M5以及M6組TK表達(dá)的持續(xù)時(shí)間也較Adv-TK組長。
　　 結(jié)論：M5以及M6在免疫全能小鼠中對(duì)腫瘤的治療作用強(qiáng)于Adv-TK，其原因與M5以及M6中腫瘤局部的病毒量以及TK表達(dá)量要高于Adv-TK組有關(guān)。
　　 第五部分 M5以及M6 體內(nèi)應(yīng)用的安全性研究
　　 目的：探討M5以及M6在體內(nèi)應(yīng)用的安全性問題。
　　 方法：分別將PBS，Ad5/dE1A，M5，M6以及Adv-TK 注

13、射入小鼠體內(nèi)，取眼動(dòng)脈血進(jìn)行肝腎功能檢測(cè)，HE 染色檢測(cè)各臟器病理反應(yīng)，real-time PCR法檢測(cè)各組織腺病毒的表達(dá)情況，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血以及脾臟中CD4+以及CD8+淋巴細(xì)胞的變化情況，TCID50 法檢測(cè)血清中抗腺病毒中和抗體。
　　 結(jié)果：同PBS組相比，M5，M6以及Adv-TK 僅引起一過性的肌酐的升高；小鼠的肝，脾，腎等也未見明顯的病理改變；M5，M6以及Adv-TK 被注射入體內(nèi)后，在肝，脾，腎中均有表達(dá)