新型溶瘤腺病毒M1體內(nèi)應(yīng)用的效應(yīng)和安全性研究及靶向性輸送的探索.pdf

1、第一部分
　　 目的：研究重組腺病毒Adv-GFP分別經(jīng)由尾靜脈注射和腹膜后注射進(jìn)入小鼠體內(nèi)后的組織分布和代謝，以評(píng)價(jià)重組腺病毒載體與肝移植結(jié)合治療肝癌的可行性和安全性。
　　 方法：分別采取尾靜脈注射和腹膜后注射純化重組腺病毒Adv-GFP 建立動(dòng)物模型,以綠色熒光蛋白(green fluorescence protein，GFP)表達(dá)作為指示觀察腺病毒的組織分布，并定量分析熒光強(qiáng)度；用原位雜交法比較各器官的腺病毒轉(zhuǎn)錄

2、水平；定量檢測(cè)病毒注射后不同時(shí)間點(diǎn)血清和肝臟中的病毒滴度。
　　 結(jié)果：兩種不同給藥方式注射Adv-GFP 入小鼠體內(nèi)后，在基因轉(zhuǎn)錄與GFP 表達(dá)上均顯示Adv-GFP 主要分布在肝、脾、肺和腎；腹膜后注射與尾靜脈注射相比，肝組織內(nèi)腺病毒轉(zhuǎn)錄與表達(dá)明顯增多(P<0.05)，而脾、肺和腎有不同程度的減弱；腹膜后注射的腺病毒亦會(huì)短時(shí)內(nèi)進(jìn)入體循環(huán)，但肝組織的病毒滴度在1w 內(nèi)的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均明顯高于尾靜脈途徑。
　　 結(jié)論：重組

3、腺病毒的腹膜后注射能夠優(yōu)化治療效果，并在一定程度上減少全身反應(yīng)，更適于肝癌肝移植后的基因治療。
　　 第二部分
　　 目的：評(píng)價(jià)新型溶瘤腺病毒M1 由靜脈途徑進(jìn)入體內(nèi)后的病毒分布、復(fù)制和代謝清除動(dòng)力學(xué)，以及M1 單獨(dú)使用的抗腫瘤效應(yīng)。
　　 方法：建立具有高頻轉(zhuǎn)移特性的人胃癌裸鼠原位移植瘤動(dòng)物模型；觀察各處理組模型鼠的生存時(shí)間；在指定時(shí)間點(diǎn)處死動(dòng)物，分離原發(fā)瘤及轉(zhuǎn)移瘤進(jìn)行病毒滴度測(cè)定；采用免疫組化和原位雜交來(lái)檢

4、測(cè)病毒的分布和活性復(fù)制；采用Western blot檢測(cè)M1的靶點(diǎn)封閉效應(yīng)。
　　 結(jié)果：在人胃癌裸鼠原位模型上，M1 經(jīng)靜脈輸注后不僅分布于胃原發(fā)瘤，而且存在于轉(zhuǎn)移灶；M1在腫瘤細(xì)胞中活性復(fù)制導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞壞死和靶基因plk1 表達(dá)降低；于成瘤早期(<2w)靜脈內(nèi)給藥可以延長(zhǎng)荷瘤鼠的生存時(shí)間(P<0.05)。
　　 結(jié)論：溶瘤腺病毒M1的靜脈內(nèi)輸注可以發(fā)揮溶瘤和靶向滅活plk1的雙重效應(yīng)，因此其單獨(dú)應(yīng)用時(shí)能夠在原發(fā)瘤和遠(yuǎn)

5、處轉(zhuǎn)移灶有效感染復(fù)制，最終清除腫瘤病灶。
　　 第三部分
　　 目的：本研究于體外分離培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，并以此為模型，探討條件復(fù)制性腺病毒對(duì)增生期和靜止期的血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)影響。
　　 方法：臍靜脈內(nèi)灌注消化液分離內(nèi)皮細(xì)胞，所獲內(nèi)皮細(xì)胞體外培養(yǎng)，經(jīng)免疫熒光染色及掃描電鏡檢查，鑒定所獲內(nèi)皮細(xì)胞及其純度；細(xì)胞病變實(shí)驗(yàn)(CPE)檢測(cè)條件復(fù)制性腺病毒Adv5/dE1A-Aschk1的細(xì)胞裂解效應(yīng)；四甲基偶氮唑鹽(

6、MTT)法檢測(cè)不同滴度腺病毒對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用；流式細(xì)胞儀分析腺病毒單用或聯(lián)合放射線的細(xì)胞凋亡。
　　 結(jié)果：血管內(nèi)灌注消化液法可獲取高純度的內(nèi)皮細(xì)胞；血管內(nèi)皮細(xì)胞與宮頸癌細(xì)胞HeLa 相比，對(duì)條件復(fù)制性腺病毒Adv5/dE1A-Aschk1 較耐受，500MOI的病毒滴度感染靜止態(tài)內(nèi)皮細(xì)胞未出現(xiàn)明顯的裂解效應(yīng)；Adv5/dE1A-Aschk1 對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制效應(yīng)隨病毒滴度的增加而增強(qiáng)，100MOI的病毒作用96

7、小時(shí)，增殖態(tài)內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)受抑(22.0±2.5)％，而靜止態(tài)內(nèi)皮細(xì)胞為(13.0±2.3)％；Adv5/dE1A-Aschk1 轉(zhuǎn)染聯(lián)合放射線處理下，增殖態(tài)內(nèi)皮細(xì)胞(凋亡細(xì)胞達(dá)35.7[％]±3.0[％])較靜止態(tài)(23.1[％]±2.5[％])更為敏感。
　　 結(jié)論：體外分離的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞可作為探討條件復(fù)制性腺病毒效應(yīng)的模型細(xì)胞；條件復(fù)制性腺病毒Adv5/dE1A-Aschk1 損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞的病毒劑量高于殺傷腫瘤細(xì)胞的

8、有效劑量,有良好的治療窗；增殖態(tài)血管內(nèi)皮與靜止態(tài)相比，更易被復(fù)制性腺病毒殺傷。
　　 第四部分
　　 目的：觀察重組腺病毒載體M1 經(jīng)尾靜脈注射和腹膜后注射及與免疫抑制療法結(jié)合體內(nèi)應(yīng)用時(shí)的免疫安全性。
　　 方法：采取尾靜脈注射和腹膜后注射純化重組腺病毒M1 建立動(dòng)物模型，連續(xù)給予環(huán)孢素A 7 d，取不同時(shí)間點(diǎn)小鼠肝組織和血清樣本，HE 染色觀察肝臟病理反應(yīng)，免疫組化方法檢測(cè)肝組織腺病毒的表達(dá)情況；同時(shí)檢測(cè)了肝臟

9、局部淋巴細(xì)胞的募集情況和腺病毒特異性的細(xì)胞免疫反應(yīng)。
　　 結(jié)果：實(shí)驗(yàn)小鼠一般情況好，無(wú)任何全身毒性表現(xiàn)，伴有輕微的一過(guò)性ALT和Cr升高，常規(guī)病理檢查僅發(fā)現(xiàn)肝組織輕微的炎癥反應(yīng)。腹膜后注射與尾靜脈注射相比，其病毒蛋白表達(dá)較尾靜脈注射組為多。加用環(huán)孢素A 能顯著降低腺病毒導(dǎo)致的ALT和Cr 升高；有效提升重組腺病毒在小鼠肝臟的濃度。
　　 結(jié)論：新型復(fù)制選擇性腺病毒M1體內(nèi)應(yīng)用是安全的，可與免疫抑制療法相結(jié)合提升其有效性

10、和安全性。
　　 第五部分
　　 目的：探索將新型溶瘤腺病毒M1 轉(zhuǎn)染腫瘤抗原特異性CTL 以達(dá)到有效清除腫瘤原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移病灶的新方法。
　　 方法：構(gòu)建CARex-Tat 融合蛋白的真核表達(dá)系統(tǒng)，利用純化的CARex-Tat 融合蛋白協(xié)助腺病毒M1 轉(zhuǎn)染體外分離誘導(dǎo)出的腫瘤抗原特異性CTL。
　　 結(jié)果：體外分離誘導(dǎo)出腫瘤抗原特異性CTL。構(gòu)建pcDNA-CARex-Tat 質(zhì)粒并獲得融合蛋白。在上皮細(xì)

11、胞的病毒感染效率檢測(cè)中，CARex-Tat 融合蛋白可以提高腺病毒允許細(xì)胞株HeLa的轉(zhuǎn)染效率(P<0.05)，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，效應(yīng)愈加明顯；但不能顯著提高腺病毒非允許細(xì)胞株NIH-3T3的轉(zhuǎn)染效率(P>0.05)。在懸浮細(xì)胞的病毒感染效率檢測(cè)中，CARex-Tat 融合蛋白可以提高K562 細(xì)胞的腺病毒轉(zhuǎn)染效率，但不能改善腫瘤抗原特異性CTL 細(xì)胞的低轉(zhuǎn)染效率。
　　 結(jié)論：體外分離誘導(dǎo)腫瘤抗原特異性CTL是切實(shí)可行的，但