豬Prdx6和Prdx2基因功能和轉(zhuǎn)錄調(diào)控分析.pdf

1、肌肉嫩度是影響肉質(zhì)品質(zhì)的重要因素，目前豬的育種工作將提高肌肉嫩度作為重要育種目標(biāo)之一。然而作為肌肉嫩度重要的候選基因Prdx6和Prdx2影響嫩度的分子機制尚不清楚。本文主要研究這兩個基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，以及對肌肉、脂肪細(xì)胞分化的影響，從而探索其中的分子機制。主要的研究結(jié)果如下:
　　(1)分析了豬Prdx6基因組織表達譜，通過5'RACE確定了豬Prdx6基因的轉(zhuǎn)錄起始位點，位于翻譯起始位點上游65bp處的腺嘌呤位點，將該位點定義為

2、+1。
　　(2)克隆了豬Prdx6基因的5'端上游調(diào)控序列1684bp，利用生物信息學(xué)方法預(yù)測豬Prdx6啟動子區(qū)，發(fā)現(xiàn)有很多轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，并且近端有4個GC-box。對得分較高的肌肉脂肪發(fā)育相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子C/EBPβ、MyoD、CREB及GC-box上的Sp1結(jié)合位點進行多序列比對發(fā)現(xiàn)序列在不同物種中的保守性也很高。通過6段缺失載體的構(gòu)建，轉(zhuǎn)染三種真核細(xì)胞，確定了啟動子的主要活性區(qū)域，然后通過該活性區(qū)域4段缺失載體的進一步構(gòu)建，

3、轉(zhuǎn)染細(xì)胞，確定了該基因轉(zhuǎn)錄活性的最小單元為HSF結(jié)合位點。
　　(3)將轉(zhuǎn)錄因子C/EBPβ、MyoD、CREB、Sp1和HSF1與相應(yīng)的啟動子載體共轉(zhuǎn)染，確定了這些轉(zhuǎn)錄因子均能提高Prdx6啟動子活性，并通過定點突變實驗進行驗證。超表達各個轉(zhuǎn)錄因子后采用定量和Western的方法驗證轉(zhuǎn)錄因子和目的基因的表達量，確定了C/EBPβ和CREB能夠促進Prdx6基因表達，干涉C/EBPβ和CREB可使Prdx6基因表達量下降。采用EM

4、SA和ChIP實驗驗證了C/EBPβ和CREB能夠結(jié)合到Prdx6基因的啟動子區(qū)相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。通過免疫沉淀實驗發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子C/EBPβ與Prdx6在蛋白水平互作，而CREB與Prdx6不存在互作關(guān)系。
　　(4)分析了豬Prdx2基因組織表達譜，通過5RACE確定了豬Prdx2基因的轉(zhuǎn)錄起始位點，位于ATG翻譯起始位點上游70bp處的鳥嘌呤位點?？寺×素iPrdx2基因的5'端上游調(diào)控區(qū)域共計2360bp，通過生物信息學(xué)分

5、析發(fā)現(xiàn)有許多轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，并存在TATA框和GC-box。通過9段缺失載體的構(gòu)建，轉(zhuǎn)染三種真核細(xì)胞，確定了啟動子的主要活性區(qū)域，然后通過該活性區(qū)域4段缺失載體的進一步構(gòu)建，轉(zhuǎn)染細(xì)胞，確定了該基因的核心區(qū)域為TATA框。
　　(5)通過定量的方法分析Prdx6和Prdx2基因在肌肉和脂肪細(xì)胞分化過程中的表達情況，確定了這兩個基因與肌肉脂肪細(xì)胞的分化有關(guān)。采用定量和Western的方法驗證了超表達和干涉Prdx6基因后對C2C12

6、細(xì)胞分化標(biāo)志基因的影響。
　　(6)檢測了C2C12細(xì)胞分化不同時期細(xì)胞內(nèi)活性氧的含量發(fā)現(xiàn)ROS水平隨細(xì)胞分化而逐漸升高。體外添加抗氧化劑NAC可以降低細(xì)胞分化中產(chǎn)生的ROS。通過超表達使內(nèi)源抗氧化物Prdx6水平升高也可以降低ROS含量，干涉使細(xì)胞內(nèi)Prdx6水平降低會使細(xì)胞ROS水平升高。
　　本研究分析了嫩度候選基因Prdx6和Prdx2的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制，提出Prdx6基因通過與C/EBPβ互作或通過調(diào)控活性氧水平參