豬DECR1和GPR81基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究.pdf

1、豬肉品質(zhì)作為豬育種工作中的重要經(jīng)濟(jì)性狀之一，已經(jīng)成為育種工作者關(guān)注的重點(diǎn)。眾所周知，脂肪性狀是影響豬肉品質(zhì)的重要因素，對(duì)其進(jìn)行深入研究將有助于我們找到改善豬肉品質(zhì)的方法。為此，本試驗(yàn)對(duì)影響脂肪性狀的兩個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了初步研究，以揭開(kāi)其轉(zhuǎn)錄調(diào)控原理的面紗，為下一步的研究奠定基礎(chǔ)。本試驗(yàn)主要從以下幾個(gè)方面對(duì)DECR1基因和GPR81基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了研究;
　　(1)通過(guò)QT-PCR技術(shù)對(duì)GPR81基因在大白豬的各個(gè)組

2、織表達(dá)情況進(jìn)行定量研究，得出GPR81基因在脂肪、肝臟以及腎臟組織中高表達(dá)，其中脂肪組織中表達(dá)量最高，其他組織中微量表達(dá)或不表達(dá)。
　　(2)通過(guò)NCBI和EBI數(shù)據(jù)庫(kù)查詢得到DECR1、GPR81基因5'端上游大約2000bp的調(diào)控序列，并對(duì)其進(jìn)行PCR克隆，分別獲得2099bp、1798bp的序列。利用生物信息學(xué)技術(shù)分別對(duì)這兩個(gè)基因的5'端上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域進(jìn)行了預(yù)測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)DECR1基因5'端上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域內(nèi)存在AP1、S

3、P1、MZF1等多種常見(jiàn)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。對(duì)CpG島分布情況分析，發(fā)現(xiàn)沒(méi)有CpG島存在;在GPR81基因5'端上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域發(fā)現(xiàn)有GATA-1、GATA-2、GATA-X、SRY、AML-1α等高分值轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。同樣，在GPR81基因5'端上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)CpG島存在。
　　(3)對(duì)DECR1、GPR81基因5'端上游序列設(shè)計(jì)一系列缺失片段，構(gòu)建各個(gè)缺失片段的雙熒光素酶報(bào)告基因載體，并分別在C2C12、3T3-

4、L1、PK15細(xì)胞中進(jìn)行雙熒光素酶活性檢測(cè)。分別對(duì)DECR1基因的DP7缺失片段和GPR81基因的GP7缺失片段進(jìn)一步構(gòu)建缺失載體，繼續(xù)進(jìn)行雙熒光活性檢測(cè)。
　　(4)對(duì)雙熒光活性測(cè)定結(jié)果進(jìn)行分析，并對(duì)雙熒光素酶活性差異顯著的缺失片段間的序列進(jìn)行生物信息學(xué)預(yù)測(cè)，找出對(duì)啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性起重要調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。通過(guò)TFSearch軟件對(duì)這兩個(gè)基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)SP1、MZF1轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子和GATA1、GATA2、GATAx轉(zhuǎn)錄調(diào)控

5、因子可能分別對(duì)DECR1基因和GPR81基因啟動(dòng)子具有顯著地調(diào)控作用。
　　(5)為了進(jìn)一步鑒定DECR1和GPR81基因5'端上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)和相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子，我們對(duì)這兩個(gè)基因各個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變，并對(duì)DECR1基因的轉(zhuǎn)錄因子SP1和GPR81基因的轉(zhuǎn)錄因子GATA1進(jìn)行超表達(dá)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，此外對(duì)SP1轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行siRNA干擾試驗(yàn)驗(yàn)證。結(jié)果顯示突變后DECR1和GPR81基因5'端上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)