結核分枝桿菌轉錄因子WhiB2蛋白的功能和轉錄調控研究.pdf

1、結核病死灰復燃,是一種嚴重危害人類健康的傳染病。2010年,估算全球新發(fā)結核病患者880萬例,未感染艾滋病的結核病患者死亡人數為110萬,另有35萬死于艾滋病病毒感染相關結核病。隨著人類社會和藥物治療的發(fā)展,人們對結核病的致病菌——結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)的生物學特性有了進一步的研究,繼而研發(fā)了鏈霉素、異煙肼、利福平等治療性藥物,使得人類對結核病的控制取得了可喜的成績,遏制了結核病的蔓延和傳播。

2、1995年至2010年間,在實施了現代結核病控制策略/遏制結核病策略的結核病防治規(guī)劃中,5500萬例結核病患者得到了治療,4600萬例患者獲得成功治療,這些治療挽救了近700萬人的生命。然而由于化學藥物的不合理應用、艾滋病與結核病共感染、人口流動的增加以及耐藥結核病菌的流行,使得近年來結核病疫情下降緩慢,在部分地區(qū)甚至有所回升。當前,在結核病控制工作中急需有效的預防性、治療性疫苗和新型藥物。尋找新的藥物作用靶點和開發(fā)新型抗結核藥物已成為

3、當前最為關注的焦點。
　　 whi基因普遍存在于放線菌屬和分枝桿菌屬中,因其突變能導致天藍色鏈霉菌菌落呈白色而得名。whiB是whi基因中的一類,其編碼的蛋白功能涉及孢子形成、細胞分裂、致病性以及營養(yǎng)缺陷等壓力傳感。經ProteinSequenceAnalysis(PSA)server分析顯示WhiB樣具有helix-turn-helix(HTH)基序,是可能的轉錄調控因子。結核分枝桿菌具有7個WhiB-like蛋白(WBL),

4、為WhiB1～7。序列分析顯示這些WBL都具有四個保守的半胱氨酸殘基,且排列為“C-X19-36-C-X-X-C-X5-7-C”,C-X-X-C可以和[2Fe-2S]配位。通過同源性分析,發(fā)現除了WhiB5和WhiB6,結核分枝桿菌中其它5個WhiB蛋白在分枝桿菌屬中的同源性都很高。但是結核分枝桿菌7個WBL蛋白的功能還沒有完全詮釋。與胰島素共孵育檢測蛋白的二硫鍵還原功能,結果表明除了WhiB2,其他6個WhiB蛋白都能夠還原胰島素的二

5、硫鍵。WhiB1是唯一的在結核分枝桿菌中被發(fā)現的受cAMP受體蛋白CRP調控的蛋白,能夠與結核分枝桿菌體內最佳生長所必需的基因glgB相互作用。WhiB3與組織損傷有關,且結核分枝桿菌調節(jié)whiB3的表達來應對體內的環(huán)境信號。M.tuberculosisH37Rv的whiB7無效突變菌株對多種抗生素(四環(huán)素,林可霉素,紅霉素)高度敏感,表明WhiB7蛋白與壓力傳感有關。在M.tuberculosisCDC1551中檢測7個WbL在不同抗

6、分枝桿菌因子和其它的壓力條件下的表達情況,結果表明作用于核糖體的氨基苷類一鏈霉素和卡那霉素一刺激whiB7的表達。在PH4.5的酸性條件下,whiB6和whiB3的表達特異性增高
　　 在恥垢分枝桿菌中過表達WhiBTM4,導致恥垢分枝桿菌表現出WhiB2敲除表型,即阻礙隔膜的形成,表明WhiBTM4下調WhiB2。研究表明結核分枝桿菌WhiB2蛋白與恥垢分枝桿菌WhmD蛋白的功能是相同的。whmD是必需基因,恥垢分枝桿菌染色體

7、上whmD的缺失導致不可逆的,分枝生長呈現減少的隔膜形成,說明該基因和細胞分裂有關,但是與細胞分裂相關的具體機制目前尚不清楚。為了研究WhiB2與細胞分裂的機制及其功能,本研究將結核分枝桿菌whiB2基因克隆到穿梭質粒pNIT-myc中,得到重組質粒pNIT-myc-whiB2,再用電穿孔的方法將重組質粒轉入恥垢分枝桿菌中得到過表達WhiB2蛋白的恥垢分枝桿菌重組菌株。然后研究whiB2的過表達對恥垢分枝桿菌的生長,對過氧化氫的敏感性及

8、對與細胞分裂有關基因的表達的影響,檢測了抗分枝桿菌抗生素對恥垢分支桿菌的MIC。結果表明whiB2的過表達對恥垢分枝桿菌的生長并沒有什么影響,卻使恥垢分枝桿菌增加了對異煙肼和卷曲霉素的敏感性,而對過氧化氫的耐受性明顯增加。RT-PCR結果顯示WhiB2的過表達使與細胞分離有關的基因MSEMG_4225和ftsZ的表達量增加。熒光顯微鏡分析顯示WhiB2蛋白的過表達使得細胞分裂加快。總而言之,我們的研究表明了結核分枝桿菌WhiB2與抗生素