低劑量X射線對(duì)骨折愈合中骨形成和成骨細(xì)胞影響的研究.pdf

1、X射線作為一種電離輻射，在醫(yī)學(xué)中有著廣泛的應(yīng)用，如惡性腫瘤的放射治療。但其對(duì)骨骼的影響主要表現(xiàn)在骨壞死、骨折延遲愈合等。經(jīng)典理論認(rèn)為輻射破壞骨和骨痂周圍的血運(yùn)、直接殺滅骨細(xì)胞和成骨前體細(xì)胞，降解骨基質(zhì)等，而這一結(jié)論是基于中高劑量的電離輻射的相關(guān)研究得出的。骨科疾病患者常常需要接受多次X射線的照射，例如患者接受X-CT、攝片檢查；術(shù)中接受X射線透視，所受的照射劑量一般小于1Gy，屬低劑量范圍水平。所以研究X射線照射對(duì)骨科相關(guān)疾病的作用，尤

2、其是低劑量X射線的作用，具有重要的意義。但低劑量X線照射對(duì)骨科相關(guān)疾病作用的研究甚少，此前我們的一些實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)大鼠閉合骨折模型，用1Gy X線的照射，促進(jìn)了骨痂中微血管的形成，從而加速骨折愈合。眾所周知，成骨細(xì)胞作為骨組織中重要的組成部分，是骨發(fā)生和骨形成的關(guān)鍵細(xì)胞之一。本實(shí)驗(yàn)旨進(jìn)一步研究低劑量X射線對(duì)骨折愈合過程中骨痂形成的影響，并探求促進(jìn)骨形成、骨生長的機(jī)理-充足的成骨細(xì)胞的增殖、分化和功能的表達(dá)是骨形成的必要條件，即了解低劑

3、量X線照射是否能促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖、分化和功能表達(dá)，以及對(duì)相關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)通路的影響。
　　 本課題包括四個(gè)部分
　　 一、構(gòu)建體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞模型
　　 為了獲得大量具有成骨活性的成骨細(xì)胞，本實(shí)驗(yàn)以MC3T3-E1 Subclone14（小鼠顱頂成骨前體細(xì)胞亞克隆14）為研究對(duì)象，經(jīng)體外成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)后，利用堿性磷酸酶染色、Von kossa染色、RT-PCR和Western Bolt檢測(cè)成骨標(biāo)志物等方法進(jìn)行成骨

4、細(xì)胞鑒定。結(jié)果顯示：經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)的MC3T3-E1 Subclone14符合成骨細(xì)胞的生物學(xué)特性，并具有良好的活性。結(jié)論：MC3T3-E1 Subclone14可以作為體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞模型。
　　 二、低劑量X射線對(duì)體外培養(yǎng)的成骨前體細(xì)胞增殖和分化的影響
　　 將MC3T3-E1細(xì)胞予以單次、劑量分別為O（對(duì)照）、0.1、0.5、1.0Gy的X射線照射。MTT法、BrdU滲入評(píng)價(jià)細(xì)胞的增殖；流式細(xì)胞技術(shù)和Annexin

5、V-FITC/PI雙標(biāo)評(píng)價(jià)細(xì)胞周期和凋亡；堿性磷酸酶(ALP)活性檢測(cè)、Von kossa染色、Real-time PCR和Western Bolt分別檢測(cè)成骨細(xì)胞分化的一些標(biāo)志物。結(jié)果顯示：不同劑量組細(xì)胞的增殖、周期和凋亡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。盡管無明顯的線性關(guān)系，0.5和1.0Gy組的ALP活性、礦化結(jié)節(jié)的數(shù)目、分化標(biāo)記物(Ⅰ型膠原、骨鈣素(OCN)、核心結(jié)合因子(Cbfa1))基因和蛋白的表達(dá)、以及骨保護(hù)素(OPG)/核因子-kB配體

6、受體激活蛋白(RANKL)基因表達(dá)的比率均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而0.1Gy組與對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：0.5和1.0Gy的X射線照射促進(jìn)了成骨細(xì)胞的分化。
　　 三、低劑量X線照射對(duì)大鼠骨折愈合過程中骨痂形成和成骨性標(biāo)志物的影響
　　 128只雄性SD大鼠隨機(jī)分為4組，每組32只。制作標(biāo)準(zhǔn)的右側(cè)股骨中段閉合骨折模型，即刻對(duì)大鼠骨折區(qū)域予以單次、劑量分別為O（對(duì)照）、0.1、0.5、1.0Gy的X射線照射。

7、分別于術(shù)后10天、2、3、4周處死大鼠獲取骨折標(biāo)本。每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)選取4個(gè)標(biāo)本，用于組織學(xué)觀察——HE染色和免疫組化標(biāo)記，鏡下觀察骨痂形成和成骨標(biāo)志物的變化。剩余4個(gè)標(biāo)本real-time PCR檢測(cè)一些成骨性標(biāo)志物mRNA表達(dá)的變化，結(jié)果顯示：1．HE染色觀察骨痂形成。1.0Gy組硬骨痂較對(duì)照組增多，軟骨內(nèi)化骨較對(duì)照組早,4周時(shí)，1.0Gy組開始有髓腔的形成。2．免疫組化觀測(cè)骨痂中成骨標(biāo)記物。隨著時(shí)間的進(jìn)展，各組中OCN表達(dá)逐步升

8、高，0.5和1.0Gy組OCN染色陽性細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組多，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。隨著時(shí)間的進(jìn)展，各組中Cbfa1表達(dá)先升高，在術(shù)后第3周達(dá)到高峰，第4周已降低。術(shù)后第2和3周，0.5和1.0Gy組Cbfa1染色陽性細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組多；第4周，0.5和1.0Gy組Cbfa1染色陽性細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3．成骨性標(biāo)志物mRNA表達(dá)的變化。盡管ALP、Ⅰ型膠原、Ⅱ型膠原、OCN、Cofal表達(dá)處在差異，但較為一致的是，在10天時(shí)，

9、各組變化差異不明顯，術(shù)后第2和3周，與對(duì)照組相比，0.5和1.0Gy組的成骨性標(biāo)志物的峰值較高，且提前出現(xiàn)。
　　 結(jié)論：0.5和1.0GyX射線照射促進(jìn)了骨折愈合過程中骨痂的形成和成骨性標(biāo)志物的表達(dá)。
　　 四、低劑量X射線對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞基因表達(dá)譜的影響
　　 為了了解低劑量X射線對(duì)成骨細(xì)胞基因表達(dá)譜的影響，我們選取了羅氏NimbleGen小鼠表達(dá)譜芯片進(jìn)行檢測(cè)。MC3T3-E1細(xì)胞經(jīng)1Gy X射線照射

10、后，繼續(xù)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)14天后，收集細(xì)胞。未照射細(xì)胞作為對(duì)照組，每組各3個(gè)樣本。細(xì)胞的RNA被抽提并純化，RNA的完整性經(jīng)過瓊脂糖變性膠檢測(cè)后，每個(gè)樣本取5μgRNA進(jìn)行雜交和標(biāo)記，步驟如下：RNA的逆轉(zhuǎn)錄；雙鏈cDNA的標(biāo)記；芯片雜交和洗滌；雜交芯片的掃描；掃描獲取圖像的數(shù)據(jù)分析。樣本經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化后，應(yīng)用T檢驗(yàn)篩選出p＜0.05，任意兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組之間差異表達(dá)在1.3倍以上的基因?yàn)椴町惢?。結(jié)果顯示成骨細(xì)胞經(jīng)1.0Gy的X射線照射后，共發(fā)現(xiàn)74

11、0個(gè)差異基因，其中384個(gè)上調(diào),356個(gè)下調(diào)。再對(duì)這些差異基因進(jìn)行GO和Pathway分析，最后進(jìn)行聚類分析，以了解這些基因在成骨細(xì)胞生物學(xué)過程中的作用。發(fā)現(xiàn)1.0Gy的X射線促進(jìn)了調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分化、鈣化基因的明顯上調(diào)。一些調(diào)控細(xì)胞外基質(zhì)、局部粘附、細(xì)胞骨架和血管形成的基因也明顯上調(diào)。而且還發(fā)現(xiàn)與細(xì)胞生長因子活動(dòng)有關(guān)的基因如表皮生長因子受體、成纖維生長因子、胰島素樣生長因子也明顯上調(diào)。由此可見，1.0Gy的X射線促進(jìn)成骨細(xì)胞分化和鈣化，

12、可能與細(xì)胞外基質(zhì)-局部粘附-細(xì)胞骨架途徑和生長因子相關(guān)信號(hào)通路有關(guān)。
　　 綜上所述，本實(shí)驗(yàn)從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)兩方面，初步探索了低劑量X射線對(duì)骨折愈合過程中骨痂形成的影響，并從細(xì)胞和分子水平研究其對(duì)成骨細(xì)胞的增殖、分化、以及相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)通路的影響。發(fā)現(xiàn)0.1Gy的X射線對(duì)骨折愈合和成骨細(xì)胞增殖和分化無明顯影響，存在閾值效應(yīng)。0.5Gy和1.0Gy的X射線促進(jìn)了骨折愈合過程中骨痂形成和成骨細(xì)胞的分化，為低劑量X射線對(duì)骨科相關(guān)疾病