氯化鋰對鈦表面成骨細胞成骨分化的影響.pdf

1、目的:
　　鋰鹽是一種人體非必須的微量元素。鋰鹽可獨立影響骨代謝，并增加骨密度，降低骨折風險。有研究表明，氯化鋰可促進骨髓間充質(zhì)干細胞和牙周膜干細胞等干細胞的成骨作用。并且，也有動物實驗表明氯化鋰作用于骨折模型小鼠和腭中縫擴大后的大鼠，其新骨形成都有所增加。然而，氯化鋰是否能促進成骨細胞成骨分化還存在爭議。目前，國內(nèi)外對氯化鋰在鈦片表面復合培養(yǎng)成骨細胞后其生長情況、分化成骨及其作用機制的研究報道比較少見。
　　本研究探索不同

2、時間點不同濃度氯化鋰對鈦片上成骨細胞增殖和成骨分化的影響，為進一步的動物實驗及臨床實驗提供基礎。
　　方法:
　　1.將實驗所用鈦片進行粗化處理，再將成骨細胞接種于鈦片上，進行體外復合培養(yǎng)。將實驗分成5個組，實驗組4個即氯化鋰組（2.5 mmol/L、5mmol/L、10mmol/L、20mmol/L）和空白組對照組（未加氯化鋰組）。
　　2.將MC3T3-E1成骨細胞接種在鈦片上培養(yǎng)，分別用含不同濃度氯化鋰的培養(yǎng)基進

3、行培養(yǎng)。用CCK8法檢測各組在第1天至第4天各時間點在450nm波長時的吸光度值，評價不同濃度氯化鋰對MC3T3-E1細胞增殖的影響。結果進行統(tǒng)計分析。
　　3.將MC3T3-E1成骨細胞接種在鈦片上培養(yǎng)，分別用含不同濃度氯化鋰的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。采用堿性磷酸酶(ALP)試劑盒測定各組細胞在第4天和第8天時ALP的活性，評價不同濃度氯化鋰對MC3T3-E1細胞成骨分化的影響。
　　4.將MC3T3-E1成骨細胞接種在鈦片上培養(yǎng)

4、，分別用含不同濃度氯化鋰的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。采用ELISA OC試劑盒檢測第6天和第12天各組OC的分泌表達，評價不同濃度氯化鋰對MC3T3-E1細胞成骨分化的影響。
　　5.將MC3T3-E1成骨細胞接種在鈦片上培養(yǎng)，分別用含不同濃度氯化鋰的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。采用實時熒光定量PCR法，檢測第6天各組成骨細胞OC mRNA、Runx2mRNA和COL-ⅠmRNA的基因表達，評價不同濃度氯化鋰對MC3T3-E1細胞成骨分化的影響。

5、>　　6.將MC3T3-E1成骨細胞接種在鈦片上培養(yǎng)，分別用含不同濃度氯化鋰的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。采用Western-blot法觀察各組Runx2和COL-Ⅰ蛋白條帶。評價不同濃度氯化鋰對MC3T3-E1細胞成骨分化的影響，評價各個蛋白條帶變化。
　　結果:
　　1.成骨細胞MC3T3-E1在鈦片表面第1天至第4天的CCK8吸光值（OD值），間接反映了細胞的增殖情況。在第1天各種濃度氯化鋰組OD值無明顯變化;在第2天時，2.5m

6、mol/L氯化鋰組OD值比空白組大，5mmol/L和10mmol/L氯化鋰組OD分別都小于空白對照組，但三組數(shù)據(jù)與空白對照組比較，差異均無統(tǒng)計學意義(p＞0.05);20mmol/L氯化鋰組OD值比空白組小(p＜0.05)，差異有統(tǒng)計學意義，說明20mmol/L氯化鋰濃度起到了抑制作用。不同濃度氯化鋰組處理MC3T3-E1細胞第3天與第4天后，其中2.5mmol/L氯化鋰組與空白對照組相比OD值大(p＜0.05)，說明該濃度促進了MC3

7、T3-E1細胞增殖(p＜0.05)。在10mmol/L和20mmol/L氯化鋰組OD值均小于空白對照組(p＜0.05)，說明這兩個濃度抑制細胞增殖作用，且隨著濃度增大抑制作用呈遞增趨勢。5mmol/L氯化鋰組比空白對照組OD值小但差異無統(tǒng)計學意義(p＞0.05)，說明該濃度對細胞增殖無明顯作用。
　　2.各濃度氯化鋰組在第4天和第8天對MC3T3-E1細胞ALP活性檢測結果顯示，僅10mmol/L和20mmol/L氯化鋰組檢測結果

8、高于空白對照組，均有統(tǒng)計學差異(p＜0.05)，且隨著濃度增大促進作用呈遞增趨勢。2.5mmol/L和5mmol/L氯化鋰組結果高于與空白對照組但差異無統(tǒng)計學意義(p＞0.05)。
　　3.各濃度氯化鋰組在第6天與第12天對MC3T3-E1細胞的骨鈣素表達量進行檢測。5mmol/L、10mmol/L和20mmol/L氯化鋰組檢測結果均小于空白對照組，且均有統(tǒng)計學差異(p＜0.05)。2.5mmol/L和氯化鋰組與空白組比較差異無統(tǒng)

9、計學意義(p＞0.05)。
　　4.各濃度氯化鋰組在第6天對Runx2mRNA、COL-Ⅰ mRNA及OC mRNA的表達進行檢測，結果顯示在2.5mmol/L氯化鋰組Runx2mRNA、COL-Ⅰ RNA基因及OC mRNA的表達水平低于空白對照組，但無顯著性差異(p＞0.05)。在5mmol/L氯化鋰組COL-Ⅰ mRNA和OC mRNA表達低于空白對照組，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)，說明對COL-Ⅰ mRNA和OC m

10、RNA表達起到了抑制作用。但此濃度Runx2 mRNA表達低于與空白對照組，差異無統(tǒng)計學意義(p＞0.05)。在10mmol/L和20mmol/L氯化鋰組Runx2 mRNA、COL-Ⅰ mRNA及OC mRNA的表達水平均低于空白對照組，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。
　　5.根據(jù)western-blot的實驗結果，在2.5mmol/L、5mmol/L氯化鋰組中Runx2和COL-Ⅰ蛋白表達均低于空白對照組，但差異無統(tǒng)計學意

11、義(p＞0.05)。在10mmol/L、20mmol/L組氯化鋰Runx2和COL-Ⅰ蛋白表達均低于與空白對照組，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。
　　結論:
　　氯化鋰在高濃度（10mmol/L和20mmol/L）抑制了成骨細胞成骨表達。在低濃度（2.5mmol/L和5mmol/L）則不影響成骨細胞成骨表達。低濃度氯化鋰（2.5mmol/L）可促進成骨細胞的增殖。本研究結果提示，氯化鋰的促成骨作用可能不是通過成骨細胞，其