氯化鋰對(duì)鈦表面成骨細(xì)胞成骨分化的影響.pdf

1、目的:
　　鋰鹽是一種人體非必須的微量元素。鋰鹽可獨(dú)立影響骨代謝，并增加骨密度，降低骨折風(fēng)險(xiǎn)。有研究表明，氯化鋰可促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和牙周膜干細(xì)胞等干細(xì)胞的成骨作用。并且，也有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明氯化鋰作用于骨折模型小鼠和腭中縫擴(kuò)大后的大鼠，其新骨形成都有所增加。然而，氯化鋰是否能促進(jìn)成骨細(xì)胞成骨分化還存在爭(zhēng)議。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)氯化鋰在鈦片表面復(fù)合培養(yǎng)成骨細(xì)胞后其生長(zhǎng)情況、分化成骨及其作用機(jī)制的研究報(bào)道比較少見(jiàn)。
　　本研究探索不同

2、時(shí)間點(diǎn)不同濃度氯化鋰對(duì)鈦片上成骨細(xì)胞增殖和成骨分化的影響，為進(jìn)一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床實(shí)驗(yàn)提供基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1.將實(shí)驗(yàn)所用鈦片進(jìn)行粗化處理，再將成骨細(xì)胞接種于鈦片上，進(jìn)行體外復(fù)合培養(yǎng)。將實(shí)驗(yàn)分成5個(gè)組，實(shí)驗(yàn)組4個(gè)即氯化鋰組（2.5 mmol/L、5mmol/L、10mmol/L、20mmol/L）和空白組對(duì)照組（未加氯化鋰組）。
　　2.將MC3T3-E1成骨細(xì)胞接種在鈦片上培養(yǎng)，分別用含不同濃度氯化鋰的培養(yǎng)基進(jìn)

3、行培養(yǎng)。用CCK8法檢測(cè)各組在第1天至第4天各時(shí)間點(diǎn)在450nm波長(zhǎng)時(shí)的吸光度值，評(píng)價(jià)不同濃度氯化鋰對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　3.將MC3T3-E1成骨細(xì)胞接種在鈦片上培養(yǎng)，分別用含不同濃度氯化鋰的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。采用堿性磷酸酶(ALP)試劑盒測(cè)定各組細(xì)胞在第4天和第8天時(shí)ALP的活性，評(píng)價(jià)不同濃度氯化鋰對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化的影響。
　　4.將MC3T3-E1成骨細(xì)胞接種在鈦片上培養(yǎng)

4、，分別用含不同濃度氯化鋰的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。采用ELISA OC試劑盒檢測(cè)第6天和第12天各組OC的分泌表達(dá)，評(píng)價(jià)不同濃度氯化鋰對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化的影響。
　　5.將MC3T3-E1成骨細(xì)胞接種在鈦片上培養(yǎng)，分別用含不同濃度氯化鋰的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法，檢測(cè)第6天各組成骨細(xì)胞OC mRNA、Runx2mRNA和COL-ⅠmRNA的基因表達(dá)，評(píng)價(jià)不同濃度氯化鋰對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化的影響。

5、>　　6.將MC3T3-E1成骨細(xì)胞接種在鈦片上培養(yǎng)，分別用含不同濃度氯化鋰的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。采用Western-blot法觀察各組Runx2和COL-Ⅰ蛋白條帶。評(píng)價(jià)不同濃度氯化鋰對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化的影響，評(píng)價(jià)各個(gè)蛋白條帶變化。
　　結(jié)果:
　　1.成骨細(xì)胞MC3T3-E1在鈦片表面第1天至第4天的CCK8吸光值（OD值），間接反映了細(xì)胞的增殖情況。在第1天各種濃度氯化鋰組OD值無(wú)明顯變化;在第2天時(shí)，2.5m

6、mol/L氯化鋰組OD值比空白組大，5mmol/L和10mmol/L氯化鋰組OD分別都小于空白對(duì)照組，但三組數(shù)據(jù)與空白對(duì)照組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05);20mmol/L氯化鋰組OD值比空白組小(p＜0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明20mmol/L氯化鋰濃度起到了抑制作用。不同濃度氯化鋰組處理MC3T3-E1細(xì)胞第3天與第4天后，其中2.5mmol/L氯化鋰組與空白對(duì)照組相比OD值大(p＜0.05)，說(shuō)明該濃度促進(jìn)了MC3

7、T3-E1細(xì)胞增殖(p＜0.05)。在10mmol/L和20mmol/L氯化鋰組OD值均小于空白對(duì)照組(p＜0.05)，說(shuō)明這兩個(gè)濃度抑制細(xì)胞增殖作用，且隨著濃度增大抑制作用呈遞增趨勢(shì)。5mmol/L氯化鋰組比空白對(duì)照組OD值小但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)，說(shuō)明該濃度對(duì)細(xì)胞增殖無(wú)明顯作用。
　　2.各濃度氯化鋰組在第4天和第8天對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞ALP活性檢測(cè)結(jié)果顯示，僅10mmol/L和20mmol/L氯化鋰組檢測(cè)結(jié)果

8、高于空白對(duì)照組，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05)，且隨著濃度增大促進(jìn)作用呈遞增趨勢(shì)。2.5mmol/L和5mmol/L氯化鋰組結(jié)果高于與空白對(duì)照組但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)。
　　3.各濃度氯化鋰組在第6天與第12天對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞的骨鈣素表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)。5mmol/L、10mmol/L和20mmol/L氯化鋰組檢測(cè)結(jié)果均小于空白對(duì)照組，且均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05)。2.5mmol/L和氯化鋰組與空白組比較差異無(wú)統(tǒng)

9、計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)。
　　4.各濃度氯化鋰組在第6天對(duì)Runx2mRNA、COL-Ⅰ mRNA及OC mRNA的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示在2.5mmol/L氯化鋰組Runx2mRNA、COL-Ⅰ RNA基因及OC mRNA的表達(dá)水平低于空白對(duì)照組，但無(wú)顯著性差異(p＞0.05)。在5mmol/L氯化鋰組COL-Ⅰ mRNA和OC mRNA表達(dá)低于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)，說(shuō)明對(duì)COL-Ⅰ mRNA和OC m

10、RNA表達(dá)起到了抑制作用。但此濃度Runx2 mRNA表達(dá)低于與空白對(duì)照組，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)。在10mmol/L和20mmol/L氯化鋰組Runx2 mRNA、COL-Ⅰ mRNA及OC mRNA的表達(dá)水平均低于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
　　5.根據(jù)western-blot的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在2.5mmol/L、5mmol/L氯化鋰組中Runx2和COL-Ⅰ蛋白表達(dá)均低于空白對(duì)照組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意

11、義(p＞0.05)。在10mmol/L、20mmol/L組氯化鋰Runx2和COL-Ⅰ蛋白表達(dá)均低于與空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　氯化鋰在高濃度（10mmol/L和20mmol/L）抑制了成骨細(xì)胞成骨表達(dá)。在低濃度（2.5mmol/L和5mmol/L）則不影響成骨細(xì)胞成骨表達(dá)。低濃度氯化鋰（2.5mmol/L）可促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖。本研究結(jié)果提示，氯化鋰的促成骨作用可能不是通過(guò)成骨細(xì)胞，其