LPS腹腔注射誘發(fā)大鼠腦內(nèi)炎癥致皮層與海馬病理改變及相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、包括神經(jīng)退行性病變?cè)趦?nèi)的多數(shù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病均可能與外周炎癥過(guò)程相關(guān)。炎癥雖可作為機(jī)體抵抗外來(lái)刺激的防御性反應(yīng)，但過(guò)度的炎癥反應(yīng)也可造成組織損傷，推動(dòng)疾病發(fā)展。外周炎癥過(guò)程可導(dǎo)致如發(fā)熱、厭食等病理反應(yīng)，提示特定炎癥物質(zhì)可將外周炎癥信號(hào)傳遞至中樞神經(jīng)系統(tǒng)。但這種炎癥信號(hào)對(duì)腦內(nèi)特定部位，如與認(rèn)知、學(xué)習(xí)記憶相關(guān)的大腦皮層和海馬等區(qū)域，是否也有影響，并導(dǎo)致相關(guān)的病理改變，其機(jī)制如何，至今未見(jiàn)系統(tǒng)報(bào)道。
　　 腹腔注射脂多糖（lipopo

2、lysaccharide，LPS）炎癥模型中，花生四烯酸代謝產(chǎn)生的炎癥物質(zhì)前列腺素E2（prostaglandinE2，PGE2）和白三烯C4（leukotrieneC4，LTC4）作用于下丘腦相關(guān)腦區(qū)，誘導(dǎo)發(fā)熱、厭食等癥狀。由于該類炎癥物質(zhì)可在腦內(nèi)廣泛產(chǎn)生并易于擴(kuò)散，因而推測(cè)，它們也可作用于大腦皮層及海馬等與認(rèn)知、記憶功能密切相關(guān)的腦區(qū)，并可能作為始動(dòng)因素誘發(fā)下游病理改變。
　　 然而，在整體炎癥模型中，大腦皮層及海馬腦區(qū)內(nèi)P

3、GE2和LTC4的生成及其合成酶系表達(dá)情況至今未見(jiàn)系統(tǒng)報(bào)道，亟需展開(kāi)相關(guān)研究。本研究第一部分采用LPS腹腔注射致腦炎模型，探索致炎后大鼠大腦皮層及海馬內(nèi)該兩炎癥物質(zhì)的生成情況，并以環(huán)氧合酶抑制劑吲哚美辛（indomethacin，INDO）作為工具藥，研究PGE2調(diào)控大腦皮層及海馬中3-硝基化酪氨酸（3-nitrotyrosine，3-NT）形成，從而論證PGE2作為始動(dòng)因素推動(dòng)腦內(nèi)相關(guān)病理改變的作用。
　　 另一方面，炎癥過(guò)程

4、誘導(dǎo)生成腫瘤壞死因子α（tumornecrosisfactorα，TNF-α），TNF-α參與各種急、慢性中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)。相關(guān)研究表明，TNF-α信號(hào)通路可上調(diào)BACE1表達(dá)造成海馬腦區(qū)內(nèi)淀粉樣蛋白生成增加，進(jìn)而推動(dòng)阿爾茨海默病（Alzheimer'sdisease，AD）的發(fā)展。BACE1直接參與淀粉樣肽（amyloidb，Aβ）形成，因而是一種具有重要病理意義的標(biāo)志性蛋白。本研究第二部分采用LPS腹腔注射致腦炎模型及體外培養(yǎng)神

5、經(jīng)元、星型膠質(zhì)細(xì)胞體系，以TNF-α抑制劑依那西普（etanercept，ETC）為工具藥，論證TNF-α信號(hào)通路干預(yù)BACE1表達(dá)的作用及其機(jī)制。
　　 本研究利用體內(nèi)、外多種炎癥生物學(xué)體系，系統(tǒng)研究以PGE2、TNF-α為主的炎癥物質(zhì)對(duì)大腦內(nèi)調(diào)控情況，既關(guān)注以大腦皮層，海馬等病理學(xué)改變?yōu)樘卣鞯脑缙诓±韺W(xué)靶點(diǎn)，又關(guān)注論證“PGE2-ONOO-3-NT/BACE1”炎癥事件，以期揭示炎癥過(guò)程推動(dòng)腦內(nèi)病理改變的生物學(xué)本質(zhì)，為尋找神

6、經(jīng)退行性改變相關(guān)的藥物作用新靶點(diǎn)提供思路。
　　 1.LPS致大鼠大腦皮質(zhì)海馬PGE2、LTC4合成酶系表達(dá)變化及3-硝基酪氨酸形成
　　 探索LPS致大鼠腦部炎癥模型中，大腦皮層及海馬區(qū)域PGE2和LTC4合成酶系表達(dá)及產(chǎn)物生成情況，并論證其對(duì)腦內(nèi)病理改變的影響。
　　 LPS（2mg/kg，i.p.）可致雄性成年SD大鼠體溫升高，幅度、時(shí)相均與文獻(xiàn)報(bào)道相符，提示腦部炎癥造模成功。大腦皮層、海馬組織mPGES-

7、1于24h內(nèi)呈時(shí)間依賴性表達(dá)上調(diào)，腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞及錐體神經(jīng)元均可見(jiàn)其表達(dá)，PGE2水平同步增高；另一方面，LPS作用1h后，在基因、蛋白水平，均可見(jiàn)大腦皮層及海馬內(nèi)LTC4S均呈現(xiàn)一過(guò)性上調(diào)，并伴隨LTC4合成能力增強(qiáng)。mGST3表達(dá)未受LPS作用影響，未檢測(cè)出上述腦區(qū)內(nèi)mGST2的表達(dá)。
　　 一氧化氮合酶（nitricoxidesynthases，NOSs）及NADPH氧化酶（NADPHoxidases，NOXs）是體內(nèi)催

8、化NO及ROS的主要酶系。研究發(fā)現(xiàn)，LPS致炎1d可導(dǎo)致海馬組織內(nèi)皮型及誘生型NOS（eNOS，iNOS）及神經(jīng)元特異性NOX4蛋白表達(dá)上調(diào)，提示海馬組織生成NO及ROS。兩者反應(yīng)生成亞硝基陰離子（peroxynitrite，ONOO），并導(dǎo)致3-NT形成，該過(guò)程與AD發(fā)病密切相關(guān)。免疫組化結(jié)果表明，LPS致炎7d可致大鼠海馬組織3-NT水平顯著上調(diào)，提示上述炎癥過(guò)程可在早期啟動(dòng)或促進(jìn)AD病程。誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是3-NT重要下游毒性機(jī)制之一

9、，westernblot結(jié)果顯示，LPS致炎7d伴隨海馬組織凋亡相關(guān)蛋白caspase-8及Bax表達(dá)上調(diào)。提示3-NT形成可能通過(guò)多種途徑參與啟動(dòng)細(xì)胞凋亡過(guò)程。INDO預(yù)給藥，可抑制LPS引起的動(dòng)物發(fā)熱，并部分抑制LPS所致海馬組織eNOS、iNOS及NOX4上調(diào)，進(jìn)而緩解海馬部位3-NT形成，及caspase-8及Bax上調(diào)，提示炎癥物質(zhì)PGE2參與調(diào)控NO及ROS生物合成，并經(jīng)由3-NT誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡影響細(xì)胞存活。
　　

10、細(xì)胞絲裂素活化蛋白激酶（mitogen-activatedproteinkinases，MAPKs）信號(hào)通路可在早期參與AD相關(guān)的多種分子生物學(xué)事件調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)INDO可在極早期顯著抑制LPS誘導(dǎo)的ERK1/2磷酸化激活，但未見(jiàn)其對(duì)p38磷酸化水平調(diào)控，提示PGE2可能經(jīng)由激活ERK1/2信號(hào)通路參與對(duì)iNOS表達(dá)調(diào)控，而p38信號(hào)通路未體現(xiàn)介導(dǎo)PGE2相關(guān)的下游分子事件。
　　 本研究結(jié)果表明，外周注射LPS致大鼠腦部炎癥模

11、型中，大腦皮層及海馬腦區(qū)內(nèi)PGE2及LTC4合成酶系表達(dá)發(fā)生變化，提示該兩炎癥物質(zhì)存在于上述腦區(qū)。外周LPS炎癥刺激通過(guò)誘導(dǎo)PGE2生成，上調(diào)海馬腦區(qū)內(nèi)NOSs及NOX4表達(dá)變化，進(jìn)而促進(jìn)3-NT形成，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡傾向增加，提示PGE2作為重要早期因素參與3-NT形成。MAPKs信號(hào)通路與上述調(diào)控過(guò)程有關(guān)。
　　 2.LPS致大鼠炎癥經(jīng)由TNF-α調(diào)控星型膠質(zhì)細(xì)胞淀粉樣前體蛋白β位剪切酶表達(dá)及機(jī)制研究
　　 本研究探索

12、炎癥介質(zhì)TNF-α、PGE2對(duì)BACE1表達(dá)的調(diào)控作用。
　　 LPS（2mg/kg,i.p.）可導(dǎo)致大鼠海馬組織內(nèi)BACElmRNA、蛋白表達(dá)、活性及其酶切產(chǎn)物分泌型淀粉樣蛋白β（secretedAPPβ，sAPPβ）呈時(shí)間依賴性上調(diào)。免疫熒光化學(xué)復(fù)染結(jié)果顯示，上調(diào)BACE1與星型膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白纖維酸性蛋白（glialfibrillaryacidicprotein，GFAP）高度重合。該結(jié)果表明，LPS致大鼠腦部炎癥過(guò)程中，

13、海馬部位星型膠質(zhì)細(xì)胞與上調(diào)BACE1密切相關(guān)，提示該炎癥過(guò)程可能經(jīng)由上調(diào)BACE1這一AD病程中的早期關(guān)鍵蛋白推動(dòng)病程發(fā)展，其中星型膠質(zhì)細(xì)胞是介導(dǎo)該作用的主要細(xì)胞類型。進(jìn)一步論研究顯示，預(yù)給予ETC（5mg/kg,sue.）可顯著降低LPS所致大鼠海馬組織BACE1蛋白及sAPPβ表達(dá)上調(diào)；蛋白定位結(jié)果顯示，上調(diào)的BACE1集中表達(dá)在星型膠質(zhì)細(xì)胞中，而不與神經(jīng)絲表達(dá)陽(yáng)性的神經(jīng)元共表達(dá)。以上結(jié)果提示了TNF-α信號(hào)通路及星型膠質(zhì)細(xì)胞在LP

14、S所致BACE1上調(diào)過(guò)程中的重要作用。
　　 為進(jìn)一步驗(yàn)證上述結(jié)果，將體外培養(yǎng)原代大鼠大腦皮層星型膠質(zhì)細(xì)胞及神經(jīng)元與TNF-α共孵育。結(jié)果表明，TNF-α在10-150ng/ml范圍內(nèi)，可濃度依賴地上調(diào)星型膠質(zhì)細(xì)胞中BACE1蛋白表達(dá)，而同濃度TNF-α不影響神經(jīng)元中BACE1蛋白表達(dá)。體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)均提示，TNF-α可通過(guò)調(diào)控星型膠質(zhì)細(xì)胞中BACE1表達(dá)，影響AD病理過(guò)程。由于INDO（2mg/kg,i.p.）未能影響LPS所致

15、大鼠海馬BACE1表達(dá)上調(diào)，提示PGE2并未參與炎癥刺激下BACE1表達(dá)調(diào)控，間接映證了TNF-α對(duì)BACE1表達(dá)的重要調(diào)控作用。
　　 TNF-α可誘導(dǎo)腦內(nèi)星型膠質(zhì)細(xì)胞激活、增殖，提示星型膠質(zhì)細(xì)胞中TNF-α信號(hào)通路與AD發(fā)病密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，LPS誘導(dǎo)外周炎癥過(guò)程中產(chǎn)生的炎癥因子TNF-α參與上調(diào)星型膠質(zhì)細(xì)胞中BACE1蛋白表達(dá)。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持TNF-α信號(hào)通路及星型膠質(zhì)細(xì)胞在AD發(fā)病過(guò)程中的重要作用。
　　

16、以上實(shí)驗(yàn)表明：
　　 1.外周注射LPS致大鼠體溫升高急性時(shí)相內(nèi)，大腦皮層及海馬組織及微血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)mPGES-1表達(dá)上調(diào)，PGE2水平增加；LTC4S呈現(xiàn)一過(guò)性表達(dá)升高，未見(jiàn)其同工酶mGST2表達(dá)，mGST3表達(dá)未受LPS影響。提示腹腔注射LPS可誘導(dǎo)大腦皮層及海馬腦區(qū)mPGES-1和LTC4S活性增加，產(chǎn)生炎癥因子PGE2及LTC4。
　　 2.外周注射LPS可導(dǎo)致海馬組織NOSs、NOX4表達(dá)依次上調(diào)，NO、RO