蕓香苷抑制脊髓損傷大鼠炎癥反應(yīng)及相關(guān)機制的實驗研究.pdf

1、目的：
　　在改良ALLEN法建立的大鼠脊髓損傷動物模型上，檢測蕓香苷是否能促進(jìn)脊髓損傷后大鼠的神經(jīng)功能恢復(fù)，改善脊髓損傷后炎癥因子浸潤，減輕炎癥反應(yīng)，并檢測蕓香苷對脊髓損傷后PI3K/AKT信號通路的影響，來探討蕓香苷發(fā)揮脊髓損傷后神經(jīng)保護作用的作用機制。
　　方法：
　　1.動物模型和分組：120只雄性成年SD大鼠，隨機分成4組，每組30只。假手術(shù)組（CON組）：切除椎板，不損傷脊髓，注射1ml的DMSO；脊髓損傷

2、組（SCI組）：根據(jù)ALLEN法建立脊髓損傷大鼠模型（T10節(jié)段），注射1ml的DMSO；甲強龍治療組（MP組）：脊髓損傷同SCI組，腹腔內(nèi)注射甲強龍30mg/kg；蕓香苷治療組（RT100組）：脊髓損傷SCI組，腹腔內(nèi)注射蕓香苷100mg/kg。
　　2.每組10只大鼠，在脊髓損傷后的第1、2、3周，采用體感誘發(fā)電位對大鼠脊髓功能進(jìn)行客觀檢測，觀察指標(biāo)選用潛伏期和波幅。在脊髓損傷后的第1、7、14、21、28天，采用BBB評分、

3、斜坡實驗和改良Tarlov評分等行為學(xué)方法評價大鼠后肢運動功能和身體平衡能力。
　　3.取材：在大鼠脊髓損傷后24小時處死動物，每組5只大鼠取新鮮脊髓用于含水量檢測；每組5只大鼠取新鮮脊髓用于ELISA、明膠酶譜法和光譜分析法；每組5只大鼠取新鮮脊髓用Western Blot實驗；每組5只大鼠經(jīng)心臟灌注4％多聚甲醛內(nèi)固定后取脊髓，放在相同固定液再固定24小時后，石蠟包埋切片用于免疫組織化學(xué)染色和HE染色。
　　4.采用免疫組

4、化染色法測定脊髓組織中IL-1β、TNF-α、MCP-1、IL-10、TGF-β、GFAP、IBA-1、Bax、Bcl-2的表達(dá)，采用HE染色觀察脊髓組織形態(tài)和病理表現(xiàn)。
　　5.采用Hsu公式測定脊髓損傷后脊髓組織含水量，采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定脊髓組織中MIP-2的含量，明膠酶譜法測定脊髓組織中MMP-9的含量，光譜分析法測定IKKβ激酶活性。
　　6.采用Western blot法檢測脊髓組織中的P-AKT

5、、NF-κB P65、Bax、Bcl-2的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.體感誘發(fā)電位結(jié)果：SCI組在第1、2、3周的SEP潛伏期與CON組比較明顯延長，SEP的波幅均明顯下降；與SCI組相比，MP組和RT100組在第1、2、3周潛伏期均呈現(xiàn)不同程度的縮短，波幅均呈現(xiàn)不同程度的升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.05）。
　　2.BBB、斜坡實驗、改良Tarlov功能評分的結(jié)果：在脊髓損傷后的每個檢測時間點，SCI組大鼠的評分

6、均明顯低于CON組；與SCI組相比，MP組和RT100組大鼠的評分雖然在第1和第7天無明顯差異，但在第14、21、28天均明顯提高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.05）。
　　3.脊髓含水量的結(jié)果：與CON組相比，SCI組的含水量明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.05）；與SCI組相比，RT100組脊髓含水量明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.01）；MP組和RT100組相比，治療效果相當(dāng)，在脊髓組織含水量上沒有差異，無統(tǒng)計學(xué)意義（

7、p＞0.05）。
　　4.HE染色結(jié)果：與CON組相比，SCI組中的神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.05）；與SCI組相比，MP組和RT100組神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)目減少受到抑制，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.05）；MP組和RT100組相比，在抑制神經(jīng)元數(shù)目減少方面，效果相當(dāng)，沒有統(tǒng)計學(xué)意義（p>0.05）。
　　5.免疫組化染色炎癥因子表達(dá)的結(jié)果：與CON組相比，SCI組中的IL-1β、TNF-α、MCP-1水平顯

8、著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.05）；與SCI組相比， RT100組和MP組IL-1β、TNF-α、MCP-1表達(dá)水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.05）；與CON組相比，SCI組中的IL-10、TGF-β水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.05）；與SCI組相比，RT100組和MP組中IL-10、TGF-β表達(dá)水平明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.05）。
　　6.ELISA檢測MIP-2含量的結(jié)果：與CON組相

9、比，SCI組中MIP-2的水平明顯增強，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.05）；與SCI組相比，MP組和RT100組中MIP-2水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.05，p<0.01）；MP組和RT100組中MIP-2表達(dá)水平?jīng)]有明顯差異(p>0.05)。
　　7.明膠酶譜法測定MMP-9活性的結(jié)果：SCI組和CON組相比，MMP-9的活性和生成量都明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.05）；與SCI組相比，MP組和RT100組中M

10、MP-9的生成量和活性明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.01）；MP組和RT100組相比，脊髓組織中MMP-9的活性和生成量沒有差異，無統(tǒng)計學(xué)意義（p>0.05）。
　　8.免疫組化染色檢測GFAP和IBA-1表達(dá)的結(jié)果：SCI組與CON組相比， GFAP、IBA-1表達(dá)水平明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.05）；與SCI組相比，RT100組和MP組GFAP和IBA-1表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.05）。
　　

11、9.光譜分析檢測IKKβ激酶活性結(jié)果：在CON組中，脊髓組織的IKKβ激酶活性較低，SCI組相比CON組中IKKβ激酶活性明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.05）；MP組和RT100組IKKβ激酶活性相比SCI組明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；MP組和RT100組相比在抑制IKKβ激酶活性上差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。
　　10.免疫組化染色和Western blot檢測Bax和 Bcl-2表達(dá)的結(jié)果：SCI組

12、與CON組相比，Bax表達(dá)水平明顯增高，而Bcl-2表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.05）；與SCI組相比，RT100組和MP組Bax的表達(dá)降低， Bcl-2的表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.05）；RT100組和MP組相比，差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（p>0.05）。
　　11.Western blot p-Akt和NF-κB P65表達(dá)的結(jié)果：CON組中p-Akt、NF-κB P65蛋白的表達(dá)較少，SCI組和CON組相比，

13、p-Akt、NF-κB P65蛋白表達(dá)明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.05）；與SCI組相比，藥物治療組在p-Akt、NF-κB P65蛋白的生成量上都有不同程度的抑制作用，RT100組和MP組能夠調(diào)節(jié)p-Akt、NF-κB P65蛋白的表達(dá)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.05）；MP組和RT100組在表達(dá)p-Akt、NF-κB P65蛋白方面無顯著差異，沒有統(tǒng)計學(xué)意義（p>0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.蕓香苷能夠縮短脊

14、髓損傷大鼠SEP潛伏期，增加波幅，改善脊髓損傷后大鼠的后肢運動能力和身體平衡能力，對脊髓損傷后大鼠的神經(jīng)功能有保護作用。
　　2.蕓香苷能夠減輕脊髓損傷后的組織水腫，減少神經(jīng)元細(xì)胞的損傷，抑制促炎因子IL-1β和TNF-α的表達(dá)，減少趨化因子MCP-1、MIP-2和MMP-9的產(chǎn)生，促進(jìn)抗炎因子IL-10和TGF-β因子的表達(dá)，抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，減輕炎癥反應(yīng)。
　　3.蕓香苷能夠抑制脊髓損傷后PI3K/AK