星形膠質(zhì)細(xì)胞TRPM2通道在LPS腹腔注射致小鼠腦內(nèi)炎癥中的機(jī)制研究.pdf

1、膿毒性腦?。╯epsis-associated encephalopathy，SAE）是感染后全身炎癥反應(yīng)所致的彌漫性大腦功能障礙和意識(shí)改變，是多臟器功能不全綜合征（multiple organdysfunction syndrome，MODS）的重要組成部分及患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。SAE的病因和病理機(jī)制非常復(fù)雜，以白細(xì)胞浸潤(rùn)、神經(jīng)元細(xì)胞變性壞死、星型膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞激活為標(biāo)志的炎癥反應(yīng)起到了重要的作用。其中星形膠質(zhì)細(xì)胞在中樞

2、神經(jīng)系統(tǒng)損傷后呈現(xiàn)保護(hù)或毒性作用的“雙相”性及活化的時(shí)空性特點(diǎn)和SAE的臨床表現(xiàn)有很好的契合性。星形細(xì)胞激活后出現(xiàn)反應(yīng)性膠質(zhì)化(reactivegliosis)、增殖遷移等狀態(tài)，胞內(nèi)游離Ca2+濃度的升高起了重要作用。星形細(xì)胞過(guò)度活化可誘發(fā)凋亡，其中定位于線粒體參與非Caspase依賴凋亡途徑的BNIP3/AIF/Endo G通路介導(dǎo)神經(jīng)凋亡亦被證實(shí)和鈣超載有關(guān)。瞬時(shí)感受器電位M2型(Transient Receptor Potenti

3、al2 Channels，TRPM2)通道是位于細(xì)胞膜上的一種多功能鈣離子通透性的非選擇性陽(yáng)離子通道，通過(guò)調(diào)節(jié)胞內(nèi)鈣離子濃度可以調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激或再灌注等病理?yè)p傷中的細(xì)胞死亡。TRPM2通道很可能參與調(diào)節(jié)了LPS誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化和凋亡。本研究通過(guò)建立LPS腹腔注射致小鼠腦內(nèi)炎癥的模型及引入TRPM2基因敲除小鼠，研究膿毒癥在小鼠腦內(nèi)的炎癥改變及星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖和膠質(zhì)化的時(shí)間規(guī)律，TRPM2在LPS致炎小鼠腦內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖和膠質(zhì)化

4、的調(diào)節(jié)作用及參與BNIP3/AIF/EndoG介導(dǎo)LPS致炎小鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡;以及通過(guò)星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)及TRPM2-siRNA轉(zhuǎn)染，進(jìn)一步研究LPS是否可以誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞的適應(yīng)性表達(dá)，以及TRPM2-siRNA轉(zhuǎn)染是否可以有效抑制LPS誘導(dǎo)的體外星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化和致炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的分泌。從而明確星形膠質(zhì)細(xì)胞TRPM2通道與膿毒性腦病的關(guān)系和分子機(jī)制，期待為防治膿毒癥及膿毒性腦病提供理論依據(jù)。

5、r>　　目的:
　　研究LPS致炎后野生型和基因敲除（TRPM2-/-）小鼠的一般行為學(xué)、腦內(nèi)炎癥改變、星形膠質(zhì)細(xì)胞活化、促炎因子分泌及凋亡的差異;同時(shí)研究LPS誘導(dǎo)后星形膠質(zhì)細(xì)胞TRPM2的表達(dá)特點(diǎn)及基因沉默后的差異，探討LPS致炎對(duì)小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化影響、誘導(dǎo)TRPM2的適應(yīng)性表達(dá)及TRPM2通道在星形膠質(zhì)細(xì)胞活化中的作用及對(duì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響。
　　方法:
　　1.動(dòng)物模型:成年雄性C57BL/6小鼠野生型小

6、鼠分別腹腔注射LPS5mg/kg、10mg/kg、25mg/kg、50mg/kg、75 mg/kg、100 mg/kg;對(duì)照組注入等量生理鹽水。監(jiān)測(cè)小鼠體溫、神經(jīng)行為學(xué)改變、驚厥發(fā)作、攝食改變及死亡率;24h后取腦HE染色觀察神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞病理變化特點(diǎn)和觀察腦膜、腦室及腦實(shí)質(zhì)炎癥反應(yīng);免疫熒光檢測(cè)小鼠海馬區(qū)GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量;TUNEL法檢測(cè)小鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡。
　　2.在體實(shí)驗(yàn):成年雄性C57BL/6小鼠野生型及同種系T

7、RPM2-/-小鼠分別腹腔注射LPS50mg/kg;對(duì)照組注入等量生理鹽水，監(jiān)測(cè)小鼠一般神經(jīng)行為學(xué)改變、死亡率;并于注射后12h，24h，48h時(shí)間點(diǎn)取小鼠腦組織，通過(guò)免疫組化、Western blot方法檢測(cè)LPS致炎后12h，24h，48h時(shí)間點(diǎn)野生型及TRPM2-/-小鼠大腦海馬區(qū)GFAP和TRPM2的表達(dá)變化和差異;熒光定量RT-PCR技術(shù)檢測(cè)不同實(shí)驗(yàn)組小鼠腦組織TNF-α，IL-1β，IL-6 mRNA的表達(dá)變化;Wester

8、n blot方法檢測(cè)海馬BNIP3/AIF/EndoG的蛋白質(zhì)表達(dá)變化。
　　3.離體實(shí)驗(yàn):培養(yǎng)純化鑒定小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞;MTT法檢測(cè)不同濃度(LPS:0μg/ml,1.0μg/ml,3.0μg/ml,5.0μg/ml,7.0μg/ml,10.0μg/ml,12.0μg/ml,15.0μg/ml)及不同時(shí)間（2h，6h，12h，24h，2d及3d）LPS刺激后星形膠質(zhì)細(xì)胞存活率;免疫熒光法檢測(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP的表達(dá)，熒光定量R

9、T-PCR法檢測(cè)TRPM2-mRNA的表達(dá)，Western blot方法檢測(cè)TRPM2蛋白的表達(dá)，ELISA法檢測(cè)星形細(xì)胞培養(yǎng)液細(xì)胞因子（TNF=α、IL-1β、IL-6）濃度變化。以75ng TRPM2-siRNA和3μl HiPerFectTransfection Reagent轉(zhuǎn)染星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行基因沉默，以10.0μg/ml LPS分別誘導(dǎo)細(xì)胞0h、24h、48h后，熒光定量RT-PCR技術(shù)檢測(cè)小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞上TRPM2mRN

10、A表達(dá)水平的變化，Western blot方法檢測(cè)TRPM2蛋白表達(dá)，ELISA法檢測(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液細(xì)胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）濃度。
　　結(jié)果:
　　1.小鼠LPS腹腔注射后有相應(yīng)體溫改變，出現(xiàn)相應(yīng)神經(jīng)行為學(xué)改變及驚厥發(fā)作、拒食現(xiàn)象以及死亡，均較對(duì)照組明顯，其中LPS(50mg/kg)腹腔注射組死亡率達(dá)到33.3％; LPS致炎后小鼠腦內(nèi)出現(xiàn)典型炎癥性病理改變，TUNEL結(jié)果還發(fā)現(xiàn)小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元出現(xiàn)凋

11、亡現(xiàn)象較對(duì)照組顯著(P＜0.05);隨著LPS刺激劑量增加小鼠海馬區(qū)GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著增加，細(xì)胞胞漿明顯增加、突起增多(P＜0.05)。
　　2.野生型小鼠海馬區(qū)GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與TRPM2表達(dá)在膿毒癥腦損傷后顯著增加，LPS致炎野生型（L組）GFAP與TRPM2表達(dá)在12h即有增多，24h達(dá)到高峰，48h略有減少，均較生理鹽水對(duì)照組（S組）顯著增多（P＜0.05）。LPS致炎后TRPM2基因敲除小鼠較野生型病死率增加，一般

12、神經(jīng)行為學(xué)指標(biāo)改善。
　　TRPM2基因敲除小鼠GFAP表達(dá)在膿毒癥腦損傷后顯著降低，TRPM2基因敲除LPS致炎組（KO/L組）小鼠海馬區(qū)GFAP陽(yáng)性細(xì)胞較野生型LPS致炎組(L組)顯著減少（P＜0.05）。小鼠海馬區(qū)可見GFAP細(xì)胞與TRPM2細(xì)胞有共聚現(xiàn)象。
　　LPS致炎后24h TRPM2基因敲除較野生型小鼠腦組織TNF-α，IL-1β，IL-6mRNA的表達(dá)下降。
　　膿毒癥腦損傷后4個(gè)實(shí)驗(yàn)組小鼠海馬區(qū)BN

13、IP3(F(3,16)=176.53，P＜0.01)、AIF(F(3，16)=98.61，P＜0.01)、EndoG(F(3，16)=60.55，P＜0.01）表達(dá)均有顯著性差異。BNIP3蛋白質(zhì)表達(dá)L組較S組顯著增加（P＜0.05），KO/L組較KO/S組（P＜0.05）和L組（P＜0.05）均顯著降低，S組與KO/S組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。AIF蛋白質(zhì)表達(dá)L組較S組顯著增加（P＜0.05），KO/L組較KO/S組（P＜0

14、.05）和L組(P＜0.05)均顯著降低。Endo G蛋白質(zhì)表達(dá)L組較S組顯著增加（P＜0.05），KO/L組較L組顯著降低(P＜0.05)，S組與KO/S組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。
　　3.不同濃度LPS刺激24h后星形膠質(zhì)細(xì)胞存活率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F(7，72)=9.39，P＜0.01）;持續(xù)刺激24h后10.0μg/ml濃度的LPS是星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖活性的臨界點(diǎn)。不同刺激時(shí)間點(diǎn)的星形膠質(zhì)細(xì)胞存活率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)

15、意義(F(1，18)=6.41，P＜0.05），早期隨著LPS刺激時(shí)間的延長(zhǎng)，星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖活性逐漸增加，且刺激24h時(shí)達(dá)高峰，在LPS刺激48h以后星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖活性明顯降低，至72h達(dá)到最低。故10.0μg/ml濃度LPS刺激48h是星形膠質(zhì)細(xì)胞從增殖轉(zhuǎn)向凋亡的臨界點(diǎn)。
　　LPS不同刺激時(shí)間點(diǎn)星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液中細(xì)胞因子TNF-α(F(1，18)=66.21，P＜0.01)、IL-1β(F(1,18)=430.76,P＜

16、0.01）、IL-6(F(1,18)=12725.06, P＜0.01）的濃度變化具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。LPS刺激12h后培養(yǎng)液中TNF-α濃度顯著上升，6h后IL-1β濃度顯著上升，2h后IL-6濃度顯著上升。LPS能誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞TRPM2 mRNA和TRPM2蛋白表達(dá)顯著增加（P＜0.05）。
　　TRPM2-siRNA轉(zhuǎn)染能顯著降低星形膠質(zhì)細(xì)胞TRPM2 mRNA和TRPM2蛋白表達(dá)（P＜0.05）。TRPM2-siRNA轉(zhuǎn)染

17、后細(xì)胞GFAP蛋白表達(dá)顯著低于非轉(zhuǎn)染組細(xì)胞GFAP蛋白表達(dá)（P＜0.05）。TRPM2-siRNA轉(zhuǎn)染能抑制LPS誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌TNF-α，IL-1β和IL-6。LPS+TRPM2-siRNA組TNF-α，IL-1β和IL-6濃度較LPS組均顯著降低（P＜0.05）。
　　結(jié)論:
　　1.小鼠LPS（50mg/kg）腹腔注射建模可誘發(fā)明顯的腦內(nèi)炎癥和神經(jīng)行為學(xué)改變，并最接近臨床膿毒癥標(biāo)準(zhǔn)。
　　2.LPS可誘導(dǎo)星

18、形膠質(zhì)細(xì)胞增殖、膠質(zhì)化及凋亡，并在時(shí)間上有一定的規(guī)律性;LPS可誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞TRPM2-mRNA和TRPM2蛋白的表達(dá)，這種表達(dá)在星形膠質(zhì)細(xì)胞屬于適應(yīng)性表達(dá);TRPM2通道參與LPS致炎小鼠腦內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖和膠質(zhì)化調(diào)節(jié)、星形膠質(zhì)細(xì)胞致炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6分泌調(diào)節(jié)及可能參與了BNIP3/AIF/EndoG介導(dǎo)的LPS致炎小鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡。
　　3.TRPM2-siRNA轉(zhuǎn)染基因沉默后可以有效抑制