PRRSV nsp1β單克隆抗體制備及蛋白質組學研究.pdf

1、1987年，在美國首次發(fā)現(xiàn)了豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS），相繼在歐洲也出現(xiàn)此病，這給世界養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經濟損失。豬繁殖與呼吸綜合征是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的一種豬的烈性傳染病。研究表明，包括PRRSV在內的一些病毒具有抑制干擾素產生，逃避免疫監(jiān)控的特點，抑制Ⅰ型干擾素的產生很大程度上歸因于非結構蛋白通過阻斷IRF3入核，從而對IFN-β啟動子和NF-κB啟動子起到抑制作用。PRRSV nsp1β在調控宿主免疫反應

2、中發(fā)揮重要作用，但具體的作用機制尚不明確。鑒于對nsp1β已有的研究，我們從蛋白質組學的角度著手挖掘nsp1β的生物學功能。在本研究中成功制備了PRRSV nsp1β單克隆抗體，并成功包裝了表達nsp1β的重組慢病毒，利用iTRAQ結合LC-MS/MS蛋白質組學技術鑒定到感染PRRSV nsp1β慢病毒的豬肺泡巨噬細胞PAM3D4/21中有425個顯著差異表達的蛋白，這些蛋白在調控天然免疫、細胞凋亡等生物進程中發(fā)揮著重要作用。主要研究內

3、容如下:
　　1.PRRSV nsp1β的表達及純化
　　將PRRSV nsp1β成功連接到pGEX-6p-1載體上，利用原核表達系統(tǒng)在大腸桿菌BL21(DE3)中表達重組蛋白，通過摸索不同的誘導表達條件，最終確定最佳表達條件為37℃、0.8mM IPTG誘導5h，蛋白以不溶性包涵體的形式存在，經純化后，獲得濃度為1.5mg/mL的純化蛋白。
　　2.PRRSV nsp1β單克隆抗體的制備
　　將純化后的nsp1

4、β蛋白作為免疫原，免疫六周齡雌性BALB/C小鼠，經過細胞融合、ELISA篩選及細胞克隆，共獲得3株能穩(wěn)定分泌抗體的細胞株，分別命名為1G7、2A8、4G10，通過IFA及Western Blot實驗對這3株細胞株的特異性進行驗證，結果顯示這3株單抗均能與PRRSV nsp1β發(fā)生特異性反應;同時也進行了小鼠單克隆抗體亞型的鑒定，3株單抗的重鏈均為IgG1型、輕鏈均為κ鏈。
　　3.PRRSV nsp1β重組慢病毒質粒的包裝

5、>　　在本研究中利用四質粒的慢病毒包裝系統(tǒng)，將PLP1、PLP2、VSVG與慢病毒表達載體CMV-MCS-3flag-EF1-copGFP-T2A-Puro共轉染于HEK-293T細胞。PRRSVnsp1β基因利用慢病毒系統(tǒng)整合到宿主細胞基因組中，并利用IFA實驗驗證了nsp1β的表達。
　　4.PRRSV nsp1β蛋白質組學數(shù)據分析
　　為了進一步研究nsp1β的所發(fā)揮的作用，本研究從蛋白質組學的角度來研究PRRSV n

6、sp1β的生物學功能。本研究采用高通量定量蛋白組學方法——iTRAQ技術定量檢測在超表達PRRSV nsp1β的PAM3D4/21細胞中宿主蛋白差異表達的情況，共鑒定到425個差異表達的細胞蛋白，包括上調186個和下調239個蛋白質。利用生物信息學分析了差異蛋白的亞細胞定位、參與的生物功能和蛋白相互作用網絡。本研究中所鑒定的這些差異蛋白涉及到細胞能量代謝、蛋白質表達、細胞凋亡、免疫調節(jié)等相關的功能，使PRRSV nsp1β可以幫助PRR