HP--PRRSV Nsp2和Nsp12單克隆抗體制備及其抗原表位的鑒定.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴重的經濟負擔，主要癥狀表現為母豬的繁殖障礙和各年齡豬的呼吸系統(tǒng)疾病。該病首次報道于20世紀80年代，現已成為養(yǎng)豬業(yè)中最重要的疾病之一。該病的病原是PRRS virus(PRRSV)。PRRSV是一種正鏈RNA病毒，屬于動脈炎病毒科動脈炎病毒屬成員。PRRSV基因組的ORF1a和ORF1b編碼復制酶多聚蛋

2、白pp1a和pp1ab，它們最終酶解為14種非結構蛋白:Nsp1α，Nsp1β，Nsp2/3/4/5/6，Nsp7α，Nsp7β以及Nsp8/9/10/11/12。其中Nsp2比較特殊，它是PRRSV基因組編碼的最大蛋白，最容易發(fā)生突變，在病毒復制周期中執(zhí)行著不同的生物學功能。非結構蛋白Nsp12是病毒復制所必須的，而對于它如何發(fā)揮功能還并不清楚。
　　本研究首先通過聚合酶鏈式反應(PCR)擴增HP-PRRSV HuN4毒株Nsp

3、2(1-233aa)和Nsp12的cDNA，并將其克隆到pET-28a載體上，命名為pET-28a-Nsp2(1-699bp)和pET-28a-Nsp12。然后表達并純化His-Nsp2(1-233aa)和His-Nsp12兩種重組蛋白，利用這兩個蛋白作為抗原免疫BALB/C小鼠并制備了三株抗PRRSV Nsp2的單抗（分別命名為4A12，4G8，8H11）和一株抗PRRSV Nsp12的單抗（命名為1E5）。Western blot和

4、IFA實驗結果表明:4A12，4G8，8H11可以識別外源性表達的Flag-Nsp2(1-233aa)和內源性表達的HP-PRRSV HuN4 Nsp2;1E5單克隆抗體可以識別外源性表達的Flag-Nsp12和內源性表達的HP-PRRSV HuN4 Nsp12。通過Western blot和ELISA的方法鑒定了4A12和1E5的識別的B細胞表位。研究結果顯示:4A12識別的B細胞表位是188ELSDDSNRPV197。1E5識別的B

5、細胞表位是130KANATSMRFH139。通過從NCBI數據庫得到的不同PRRSV毒株間序列的比較發(fā)現，188ELSDDSNRPV197在2型PRRSV的HP-PRRSV毒株中相對保守，而130KANATSMRFH139在2型PRRSV的HP-PRRSV毒株中高度保守，但在2型PRRSV的經典毒株以及1型PRRSV中卻不保守。
　　總之，本項研究通過細胞融合技術制備了3株抗HP-PRRSV Nsp2單克隆抗體和1株抗Nsp12的