豬繁殖與呼吸綜合征病毒nsp1α的原核表達(dá)及多克隆抗體和單克隆抗體的制備.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratorysyndrome virus，PRRSV)引起的一種傳染病，該病的主要特征是母豬出現(xiàn)繁殖障礙以及仔豬出現(xiàn)嚴(yán)重的呼吸道癥狀。自1987年在美國(guó)首次發(fā)現(xiàn)以來(lái)，在全球主要養(yǎng)豬國(guó)家廣泛流行。1996年郭寶清等從豬場(chǎng)流產(chǎn)胎兒分離

2、出該病毒，證實(shí)了我國(guó)存在PRRS的流行。在此后的時(shí)間里，該病在國(guó)內(nèi)大部分地區(qū)流行并在部分地區(qū)呈上升趨勢(shì)，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了極大的經(jīng)濟(jì)損失。
　　PRRSV是一種有囊膜的單股正鏈RNA病毒。研究表明，該病毒感染機(jī)體后能夠引起免疫抑制，形成持續(xù)性感染，具有抗體依賴性增強(qiáng)作用，并且病毒基因組遺傳變異顯著。病毒基因組編碼的蛋白可劃分為結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白。非結(jié)構(gòu)蛋白的功能主要作用在病毒RNA復(fù)制合成階段并能夠調(diào)控宿主對(duì)病毒的免疫反應(yīng)過(guò)程。

3、非結(jié)構(gòu)蛋白1α(nsp1α)含有鋅指結(jié)構(gòu)域、木瓜蛋白酶樣半胱氨酸蛋白酶活性區(qū)域、C-末端延伸區(qū)等區(qū)域，能夠抑制Ⅰ-干擾素產(chǎn)生，在PRRSV逃逸機(jī)體免疫的過(guò)程中起到重要的作用。
　　本研究擴(kuò)增出nsp1α基因片段，構(gòu)建原核重組質(zhì)粒，表達(dá)重組蛋白作為免疫原，免疫動(dòng)物后獲得多克隆抗體及單克隆抗體。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容主要包括:
　　1、PRRSV nsp1α原核表達(dá)及多克隆抗體的制備
　　以真核重組質(zhì)粒pcDNA3.1-nsp1α為模板

4、，擴(kuò)增出nsp1α片段，構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a-nsp1α，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)并優(yōu)化培養(yǎng)條件。在37℃條件下，1mM誘導(dǎo)劑異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)4h，菌液超聲破碎后SDS-PAGE電泳表明重組蛋白以包涵體形式大量表達(dá);大量誘導(dǎo)菌液并超聲破碎，高速離心后得到包涵體，經(jīng)過(guò)一系列緩沖液洗滌后用8M尿素緩沖液溶解包涵體，復(fù)性的包涵體作為免疫原免疫新西蘭大白兔。免疫三次后，以包涵體復(fù)性液作為包被抗原，間接ELI

5、SA檢測(cè)兔多克隆抗體血清，血清效價(jià)達(dá)到1∶2048000以上。
　　2、PRRSV nsp1α原核表達(dá)及單克隆抗體的制備
　　以真核重組質(zhì)粒pcDNA3.1-nsp1α為模板，擴(kuò)增出nsp1α片段，構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a-nsp1α，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，在37℃條件下，1mM誘導(dǎo)劑異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)6h，SDS-PAGE蛋白電泳表明重組蛋白以包涵體形式大量表達(dá)，用8M尿素緩沖液溶解包涵體

6、后，采用透析復(fù)性;復(fù)性的重組蛋白包被ELISA板，間接ELISA表明重組蛋白能夠識(shí)別豬PRRSV陽(yáng)性血清與陰性血清，具有較好的免疫學(xué)反應(yīng)活性;重組蛋白免疫BALA/c小鼠，三次免疫后加強(qiáng)免疫一次，取小鼠脾臟細(xì)胞與SP2/0瘤細(xì)胞融合，以pET28a-nsp1α重組蛋白作為包被抗原，間接ELISA初次篩選陽(yáng)性融合細(xì)胞，間接免疫熒光試驗(yàn)進(jìn)一步篩選，最后得到穩(wěn)定分泌nsp1α抗體的雜交瘤細(xì)胞;雜交瘤細(xì)胞注射小鼠腹腔，一周后收集腹水，間接ELI