缺氧誘導因子1-α和Notch1的關(guān)系及其在阿爾茨海默病中的研究.pdf

1、目的：研究中樞神經(jīng)系統(tǒng)中HIF-1α和Notch1間的關(guān)系，并探討其在阿爾茨海默病發(fā)病機制中的作用。
　　方法：體外原代培養(yǎng)小鼠皮層神經(jīng)元及膠質(zhì)細胞的混合體系，通過電穿孔轉(zhuǎn)染法沉默細胞中HIF-1α/ Notch1的基因表達，應用RT-PCR及western blot方法檢測相應Notch1/HIF-1α基因及蛋白水平的表達變化。應用ADDLs干預原代培養(yǎng)的神經(jīng)元及膠質(zhì)細胞的混合體系，建立AD的體外細胞模型，應用western b

2、lot方法檢測不同時點（4,小時，12小時，24小時）不同條件下（空白對照組，空白對照+ADDLs組，沉默HIF-1α/Notch1組，沉默HIF-1α/Notch1+ADDLs組）細胞內(nèi)HIF-1α/ Notch1的表達情況。并檢測應用ADDLs干預細胞后不同條件不同時點細胞凋亡相關(guān)蛋白caspase-3的表達情況。應用APPSWE轉(zhuǎn)基因小鼠作為AD模型鼠，建立缺氧實驗動物模型，應用western blot方法檢測不同分組（野生型正常

3、氧組,野生型缺氧組，APPSWE正常氧組,APPSWE缺氧組）實驗動物腦內(nèi)HIF-1α和Notch1的表達情況。
　　結(jié)果：1、在小鼠體外原代皮層神經(jīng)元及膠質(zhì)細胞的混合培養(yǎng)體系中，抑制HIF-1α/Notch1的表達會相應的降低Notch1/HIF-1α的表達水平；2、在AD的體外細胞模型中，ADDLs促進HIF-1α及Notch1的表達（無論是在空白對照組還是在基因沉默組，ADDLs均可上調(diào)這兩種條件下細胞內(nèi)HIF-1α/Not

4、ch1的表達水平），且HIF-1α與Notch1的表達水平變化呈正相關(guān)；3、抑制HIF-1α/Notch1的基因表達會相應的降低ADDLs所誘導的這二者的增高趨勢；4、ADDLs使細胞內(nèi)caspase-3的表達明顯升高，但是抑制細胞內(nèi)HIF-1α或者Notch1的表達均可降低這種趨勢，但抑制HIF-1α/Notch1表達的這種保護作用隨著ADDLs作用時間的延長而減弱；5、在AD模型鼠的動物實驗中，與野生型正常氧組的小鼠相比，APPSW

5、E正常氧組的小鼠腦內(nèi)HIF-1α與Notch1的表達是增高的；6、在急性缺氧動物模型中，急性缺氧的應激條件使野生型小鼠和APPSWE小鼠腦內(nèi)的HIF-1α與Notch1的表達均明顯增高，且HIF-1α與Notch1的表達變化呈正相關(guān)，但野生型缺氧組小鼠HIF-1α與Notch1的表達增高程度更甚。
　　結(jié)論：1、無論是在正常培養(yǎng)條件下的體外原代神經(jīng)元及膠質(zhì)細胞的混合培養(yǎng)體系，還是ADDLs所誘導的AD體外細胞模型，還是在AD動物模

6、型中HIF-1α和Notch1是密切相關(guān)的；2、HIF-1α/Notch1與ADDLs所誘導的細胞凋亡相關(guān)。也就是說，無論是在生理條件下還是在病理條件下，HIF-1α與Notch1均是密切相關(guān)，且二者參與了ADDLs誘導的細胞凋亡過程，可能在AD的發(fā)生發(fā)展過程有重要的作用。
　　第一部分：HIF-1α和Notch1在原代培養(yǎng)的神經(jīng)元及膠質(zhì)細胞的混合體系中的相互作用
　　目的：研究HIF-1α和Notch1之間在原代培養(yǎng)的神經(jīng)

7、元及膠質(zhì)細胞的混合體系（即模擬體內(nèi)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)）中是否存在相互作用。
　　方法：體外原代培養(yǎng)神經(jīng)元及膠質(zhì)細胞的混合體系，應用電穿孔轉(zhuǎn)染方法沉默HIF-1α/Notch1的基因表達，檢測沉默后相應基因及蛋白水平的表達變化情況，選擇轉(zhuǎn)染效率高的siRNA用于本次實驗。沉默HIF-1α的基因后應用RT-PCR及Western blot方法檢測Notch1基因及蛋白的表達水平；相應的，沉默Notch1的基因后檢測HIF-1α的基因及蛋白

8、的表達變化。
　　結(jié)果：在原代培養(yǎng)的神經(jīng)元及膠質(zhì)細胞的混合體系中，應用電穿孔轉(zhuǎn)染法可以有效地沉默HIF-1α和Notch1的基因表達。沉默HIF-1α的基因表達會降低Notch1基因及蛋白的表達水平，相應的沉默Notch1的基因表達降低HIF-1α基因及蛋白的表達水平。結(jié)論：在原代培養(yǎng)的神經(jīng)元及膠質(zhì)細胞的混合體系（模擬體內(nèi)中樞神經(jīng)系統(tǒng)）中，HIF-1α和Notch1之間存在相互作用的關(guān)系。
　　第二部分：HIF-1α和Not

9、ch1在AD細胞模型中的關(guān)系及作用
　　目的：研究在AD的體外細胞模型中，HIF-1α和Notch1之間是否存在相互作用。方法：應用 ADDLs干預原代培養(yǎng)的小鼠皮層神經(jīng)元及膠質(zhì)細胞的混合體系從而建立AD的體外細胞模型，分別干預4小時，12小時，24小時，并將細胞分為對照組，對照+ADDLs組，電穿孔轉(zhuǎn)染組，電穿孔轉(zhuǎn)染組+ADDLs組，觀察不同干預時間點不同組別的細胞抑制其HIF-1α和Notch1的基因表達后，HIF-1α和No

10、tch1的表達水平的變化情況，觀察兩者之間是否存在關(guān)系。檢測4小時，24小時時間點不同組別的細胞中凋亡相關(guān)蛋白caspase-3mRNA的表達水平。
　　結(jié)果：1、與空白對照組的細胞相比，應用電穿孔轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染HIF-1α/Notch1的siRNA的細胞中HIF-1α/Notch1的表達明顯下降；2、空白對照組的細胞在應用ADDLs處理后與未處理組的細胞相比，HIF-1α/Notch1的表達水平明顯升高，且這種增高的趨勢隨著時間的延

11、長（4小時，12小時，24小時）也逐漸增高；3、應用ADDLs干預且轉(zhuǎn)染HIF-1α/Notch1 siRNA的細胞與僅轉(zhuǎn)染siRNA的細胞相比，HIF-1α/Notch1的表達明顯升高，且這種增高的趨勢隨著時間的延長（4小時，12小時，24小時）也逐漸增高；4、HIF-1α/Notch1 siRNA+ADDLs組與空白對照+ADDLs組相比，HIF-1α/Notch1的表達是呈降低的趨勢，也就是說ADDLs誘導的HIF-1α和Notc

12、h1的表達增高在空白對照組更明顯；5、應用ADDLs干預4小時之后，空白對照組的caspase-3的表達明顯升高，但增高的程度與應用 ADDLs干預24小時相比無明顯區(qū)別；6、應用 ADDLs干預4小時且轉(zhuǎn)染HIF-1α/Notch1 siRNA組的細胞與僅用ADDLs干預4小時的細胞相比，caspase-3的表達明顯降低，但是ADDLs干預24小時后這種趨勢不明顯，兩組細胞（ADDLs干預且轉(zhuǎn)染HIF-1α/Notch1 siRNA的

13、細胞組，僅用ADDLs干預的細胞組）中caspase-3的表達無明顯變化。
　　結(jié)論：在ADDLs干預的AD體外細胞模型中HIF-1α和Notch1的表達變化一致，呈正相關(guān)的關(guān)系，且兩者對ADDLs誘導的細胞的凋亡有影響。
　　第三部分：HIF-1α和Notch1在AD動物模型中的關(guān)系
　　目的：研究在APPSWE轉(zhuǎn)基因的AD動物模型中，HIF-1α和Notch1的關(guān)系。
　　方法：擴增AD模型鼠的群組，建立AD

14、模型鼠的缺氧模型，檢測不同組別（野生型正常氧組，野生型缺氧組，APPSWE正常氧組，APPSWE缺氧組）的HIF-1α和Notch1的表達情況。
　　結(jié)果：1、APPSWE正常氧組的小鼠腦內(nèi)HIF-1α和Notch1的表達較野生型正常氧組有增高的趨勢；2、野生型缺氧組的小鼠腦內(nèi)HIF-1α和Notch1的表達較野生型正常氧組明顯增高；3、APPSWE缺氧組的小鼠腦內(nèi)HIF-1α和Notch1的表達較APPSWE正常氧組增高，但增高