鈉離子依賴(lài)的中性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2(SNAT2)多克隆抗體的制備、純化及檢測(cè).pdf

1、目的:鈉離子依賴(lài)的中性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2(Sodium-dependentneutralaminoacidtransporter2，SNAT2)是SLC38蛋白家族中的一員，跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)小的中性氨基酸，廣泛表達(dá)于哺乳動(dòng)物組織中。SNAT2的功能紊亂可以導(dǎo)致許多神經(jīng)性疾病，如阿爾茨海默癥、帕金森癥等。在大腦中，SNAT2主要轉(zhuǎn)運(yùn)谷氨酰胺進(jìn)入細(xì)胞，參與谷氨酸-谷氨酰胺的循環(huán)，因此具有重要的生理功能。本研究通過(guò)克隆編碼SNAT2蛋白氨基端75個(gè)氨基

2、酸基因，構(gòu)建pET28-SNAT2-75aa原核表達(dá)載體，誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)，并用純化的目的蛋白免疫大白兔獲得SNAT2多克隆抗體?？贵w經(jīng)親和純化，得到特異性強(qiáng)、檢測(cè)效率高的SNAT2多抗，為SNAT2蛋白功能及其結(jié)構(gòu)的深入研究奠定了生化基礎(chǔ)。
　　方法:本研究采用PCR方法擴(kuò)增得到SNAT2氨基端75個(gè)氨基酸的編碼序列，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a-SNAT2-75aa，并將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中，通過(guò)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)重組

3、蛋白。利用組氨酸標(biāo)簽蛋白經(jīng)鎳柱親和純化后得到了純度在95％以上的SNAT2氨基端蛋白SNAT2-75aa，將其作為免疫原免疫新西蘭大白兔，從而獲得SNAT2多克隆抗體。采用巰丙基瓊脂糖凝膠6B(Thiopropylsepharose)固定抗原親和純化法進(jìn)一步對(duì)該抗體進(jìn)行純化，蛋白免疫印跡確定該抗體對(duì)SNAT2具有高度的特異性。
　　結(jié)果:純化前的SNAT2抗體，經(jīng)間接ELISA檢測(cè)其效價(jià)為1∶512000，但Westernblot

4、檢測(cè)結(jié)果并不理想。采用巰丙基瓊脂糖凝膠6B(Thiopropylsepharose)固定抗原親和純化法進(jìn)一步對(duì)該抗體進(jìn)行純化，用Westernblot的方法檢測(cè)親和純化后的SNAT2多克隆抗體，對(duì)融合蛋白SANT2-75aa和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的全長(zhǎng)SNAT2蛋白的特異性，結(jié)果顯示純化后的SNAT2抗體對(duì)SNAT2蛋白氨基端75個(gè)氨基酸及SNAT2蛋白均具有高度特異性，且檢測(cè)效價(jià)至少提高了十倍。
　　結(jié)論:在原核表達(dá)系統(tǒng)中成功表達(dá)